遗传性神经退行性疾病的细胞模型、构建方法及监测方法

本发明涉及生物医学，具体涉及一种遗传性神经退行性疾病的细胞模型、构建方法及监测方法。

背景技术：

1、帕金森病（parkinson's disease, pd）是最为常见的神经退行性疾病，全球有超过600万帕金森病患者。全球病例中约5% - 25%的pd患者携带葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase，gcase or gba）基因突变，gba突变被认为是pd最重要的遗传风险因素。

2、gba是定位于细胞溶酶体中与脂代谢相关的水解酶，特异性的将糖脂葡糖神经酰胺（glycolipid glucosylceramide，glccer）水解为葡萄糖和神经酰胺。2004年首次报道了gba基因突变与pd之间的显著相关性。目前已有超过300多个gba基因有害突变被报道，而根据gba突变后对其编码产物活性的影响，可将gba突变分为轻度突变（mild mutation）和重度突变（severe mutation），其中n370s和l444p最为常见，而l444p突变体属于重度突变，在亚洲人群更常见。因此，对l444p突变体与pd发病机制的深入研究对我国pd人群的诊断和治疗具有重要意义。

3、目前普遍认为gba突变导致的正常水解活性降低/丧失（loss of function）或者细胞毒性活性增强（gain of toxic function）将导致细胞脂代谢紊乱，引起包括glccer累积、溶酶体活性异常、线粒体衰老、变性蛋白聚集、胞内囊泡转运系统异常等一系列系统性细胞毒性事件，最终引发细胞损伤和/或者凋亡。尽管已开展了大量相关研究，然而，对于gba突变与pd发病的确切机制尚不明确。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种遗传性神经退行性疾病的细胞模型、构建方法及监测方法，该细胞模型具有gba突变，可用于研究gba突变在帕金森病发生早期的机制。

2、为此，第一方面，本发明提供一种遗传性神经退行性疾病的细胞模型的构建方法，包括：制备具有gba突变的诱导性神经干细胞insc-gba，对所述insc-gba向多巴胺能神经元进行定向分化。

3、所述gba突变指葡萄糖脑苷脂酶发生突变。在一些实施方式中，所述gba突变包括l444p、l444r、n370s、e326k、t326k、f252i中的至少一种。

4、在一些实施方式中，所述定向分化的具体步骤包括：对所述insc-gba依次进行以下培养：

5、第一阶段培养，在培养的前10天，应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有sag1和fgf8；

6、第二阶段培养，在所述第一阶段培养之后，应用第二阶段培养基进行培养；所述第二阶段培养基含有camp、dapt、ascorbic acid、bdnf、gdnf和tgf-b3。

7、在一些实施方式中，所述具有gba突变的诱导性神经干细胞insc-gba的制备方法包括：提供具有gba突变的外周血样本，提取外周血单个核细胞，再将所述外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞。

8、在一些实施方式中，在所述定向分化之前还包括以下步骤：向所述insc-gba转染线粒体荧光探针。在一些实施例中，所述线粒体荧光探针选自具有线粒体靶向功能的tdtomato荧光蛋白，即mito-tdtomato。

9、本发明的第二方面，提供一种遗传性神经退行性疾病的细胞模型，其根据本发明第一方面所述的构建方法构建得到。

10、本发明的第三方面，提供一种监测方法，所述监测方法为动态监测方法，其包括：提供微流控芯片，所述微流控芯片包括第一细胞培养室和第二细胞培养室，所述第一细胞培养室与所述第二细胞培养室由多条互相平行的微通道相连通，所述微通道的长度为150~900μm；在所述第一细胞培养室中，按照本发明第一方面所述的遗传性神经退行性疾病的细胞模型的构建方法进行分化培养；在所述分化培养过程中进行监测。

11、在一些实施方式中，所述监测方法包括：活细胞成像、免疫染色成像、荧光成像等。

12、在一些实施方式中，所述监测包括：所述insc-gba分化为神经元后，神经元轴突沿所述微通道生长，对所述微通道内的轴突进行监测。

13、在一些实施方式中，所述监测包括：对细胞形态进行动态观察监测；所述监测的时间为：分化培养的第0~36天。

14、在一些实施方式中，接种所述insc-gba之前还包括以下步骤：对所述微流控芯片进行预包被。

15、在一些实施方式中，所述微通道的长度为150μm、450μm或900μm。可以根据轴突的长度、监测时间的长短等选择合适的微通道长度。

16、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

17、（1）本发明提供了一种遗传性神经退行性疾病的细胞模型，该细胞模型具有gba突变，可用于研究gba突变在帕金森病发生早期的机制。

18、（2）本发明提供了该细胞模型的构建方法，从携带有相关基因突变的患者的外周血为样本，即可制备得到具有相应突变的insc细胞，并且可通过分阶段诱导，向多巴胺能神经元定向分化。

19、（3）本发明还提供了适用于该细胞模型的实时监测方法，该监测方法通过引入微流控培养装置克服了神经元轴突难以观察的问题，实现了对神经元生长过程的实时监测，有助于深入研究gba突变对轴突线粒体功能和结构的影响，并更好地探究gba突变与神经退行性疾病的确切机制。

技术特征：

1.一种遗传性神经退行性疾病的细胞模型的构建方法，其特征在于，包括：制备具有gba突变的诱导性神经干细胞insc-gba，对所述insc-gba向多巴胺能神经元进行定向分化。

2.如权利要求1所述的遗传性神经退行性疾病的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述gba突变包括l444p、l444r、n370s、e326k、t326k、f252i中的至少一种。

3.如权利要求1所述的遗传性神经退行性疾病的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述定向分化的具体步骤包括：对所述insc-gba依次进行以下培养：

4.如权利要求1所述的遗传性神经退行性疾病的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述具有gba突变的诱导性神经干细胞insc-gba的制备方法包括：提供具有gba突变的外周血样本，提取外周血单个核细胞，再将所述外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞。

5.如权利要求1所述的遗传性神经退行性疾病的细胞模型的构建方法，其特征在于，在所述定向分化之前还包括以下步骤：向所述insc-gba转染线粒体荧光探针；所述线粒体荧光探针为mito-tdtomato。

6.一种遗传性神经退行性疾病的细胞模型，其特征在于，所述遗传性神经退行性疾病的细胞模型根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法构建得到。

7.一种监测方法，其特征在于，所述监测方法为动态监测方法，所述监测方法包括：提供微流控芯片，所述微流控芯片包括第一细胞培养室和第二细胞培养室，所述第一细胞培养室与所述第二细胞培养室由多条互相平行的微通道相连通，所述微通道的长度为150~900μm；在所述第一细胞培养室中，按照权利要求1-5中任一项所述的遗传性神经退行性疾病的细胞模型的构建方法进行分化培养；在所述分化培养过程中进行监测；

8.如权利要求7所述的监测方法，其特征在于，所述监测包括：所述insc-gba分化为神经元后，神经元轴突沿所述微通道生长，对所述微通道内的轴突进行监测。

9.如权利要求7所述的监测方法，其特征在于，所述监测包括：对细胞形态进行动态观察监测；所述监测的时间为：分化培养的第0~36天。

10.如权利要求7所述的监测方法，其特征在于，接种所述insc-gba之前还包括以下步骤：对所述微流控芯片进行预包被。

技术总结本发明涉及一种遗传性神经退行性疾病的细胞模型、构建方法及监测方法，该细胞模型的制备方法包括：制备具有GBA突变的诱导性神经干细胞iNSC‑GBA，对所述iNSC‑GBA向多巴胺能神经元进行定向分化。该细胞模型可用于研究GBA突变在帕金森病发生早期的机制。本发明还提供了适用于该细胞模型的实时监测方法，该监测方法通过引入微流控培养装置克服了神经元轴突难以观察的问题，实现了对神经元生长过程的实时监测，有助于深入研究GBA突变对轴突线粒体功能和结构的影响，并更好地探究GBA突变与神经退行性疾病的确切机制。技术研发人员：韩德强,陈志国,郑伟,李欣受保护的技术使用者：首都医科大学宣武医院技术研发日：技术公布日：2024/8/1