一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒、染色方法和应用与流程

本发明涉及临床病理检测，具体为一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒、染色方法和应用。

背景技术：

1、免疫组织化学又称免疫细胞化学染色，是病理学诊断、鉴别诊断、肿瘤特异性分子靶标筛选、鉴定的最重要平台性技术。该技术基于免疫学原理中的抗原-抗体反应，通过化学反应使标记于抗体的显色剂显色，从而实现对组织细胞中抗原的定位、定性及相对定量研究。传统免疫组化技术通常针对单一抗原进行染色，而鉴于肿瘤早期发现、早期诊断和早期治疗的三早原则，以及对小体积组织病变样本的珍贵性，开发一种能够在单张组织细胞切片上同时检测多个抗原靶标及弹力纤维染色的技术尤为重要，进而多色免疫组化技术得到发展，使得在同一张组织切片上观察多个抗原极大的促进了对不同蛋白表达相互关系的理解，尤其在前列腺、乳腺、消化道等多疾病领域的病理诊断中显示出极大的重要性。

2、自2010年肺腺癌的多学科分类更新以来，临床及病理诊断的认识水平得到了显著提升，诊断标准得到了明确和完善。然而，实际工作中的诊断一致性问题较为突出，严重影响患者的治疗和预后。传统的细胞角蛋白7(ck7)免疫组化和弹力纤维双重染色技术中，ck7在肺泡上皮细胞和肺腺癌细胞胞质中的棕褐色着色与维多利亚蓝对弹力纤维的深蓝色波浪状着色之间的对比并不总是清晰，且肺泡壁结构的显示不够明确，判断仍有难度。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒、染色方法和应用，解决了上述背景技术中提出的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

5、根据本发明的第一方面，提供了一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒，包括组合一抗，所述组合一抗包括不同种属的抗ck7和cd34单克隆抗体。

6、优选的，所述组合一抗包括兔抗人ck7单克隆抗体和鼠抗人cd34单克隆抗体。

7、优选的，所述试剂盒中还涉及以下组分：过氧化氢阻断剂、二抗试剂、dab显色液、快红系列显色剂、苏木素复染液、返蓝液、维多利亚蓝染液、95％乙醇和无水乙醇。

8、优选的，所述二抗试剂包括：

9、1)为不同种属的辣根过氧化物酶标记的二抗聚合物试剂和碱性磷酸酶标记的二抗聚合物试剂；

10、或2)为由不同种属的辣根过氧化物酶标记的二抗聚合物和碱性磷酸酶标记的二抗聚合物混合的二抗试剂。

11、进一步优选的，所述快红系列显色剂包括快红色原前体、快红色原修饰物和快红底物，所述快红色原前体、快红色原修饰物和快红底物的质量比为1:1:1。

12、所述dab显色液包括dab色原和dab缓冲液，所述dab色原和dab缓冲液的质量比为1:1。

13、所述dab缓冲液包含咪唑盐酸缓冲液、过氧化氢。

14、根据本发明的第二方面，提供了一种双重免疫组化结合弹力纤维的染色方法，对待测组织切片进行常规烤片、脱蜡水化、抗原热修复、内源性过氧化氢酶的封闭等处理，使用组合一抗对待测组织切片进行孵育，再使用二抗试剂对待测组织切片进行孵育，使用快红系列显色剂对待测组织切片进行孵育染色，然后再使用dab显色液进行孵育显色，苏木素衬染返蓝后直接使用维多利亚蓝染色，后常规脱水透明封片。

15、作为一种具体的双重免疫组化结合弹力纤维的染色方法，包括以下步骤：

16、(1)对烤片、脱蜡水化处理后的待测组织切片进行常规抗原热修复；

17、(2)向待测组织切片中滴加过氧化氢阻断剂，进行内源性过氧化氢酶的封闭；

18、(3)使用组织一抗对待测组织切片进行孵育，再使用二抗试剂对待测组织切片进行孵育，所述组织一抗包括兔抗人ck7单克隆抗体和鼠抗人cd34单克隆抗体；

19、(4)使用快红系列显色剂对待测组织切片进行孵育染色，然后再使用dab显色液进行孵育显色；

20、(5)纯水清洗待测组织切片，滴加苏木素染色液孵育，再滴加返蓝液孵育，最后再使用维多利亚蓝染液孵育；

21、(6)将待测组织切片依次通过95％乙醇和无水乙醇浸染，室温晾干。

22、根据本发明的第三方面，提供了上述双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒或染色方法在病理组织染色及诊断中的应用。

23、(三)有益效果

24、本发明提供了一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒、染色方法和应用。具备以下有益效果：

25、1、本方案提供的双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒，组织一抗选自ck7和cd34两种抗原靶标，再结合单独维多利亚蓝染色，ck7在待测组织切片中的肺泡上皮、肿瘤腺上皮细胞胞质中呈红色着色，cd34在待测组织切片中的肺泡隔间内内皮细胞呈现棕褐色着色，可以明确显示肿瘤上皮是否贴附与肺泡壁生长，可以有效区别肿瘤所致肺泡间隔纤维组织增生、多种因素所致的肺泡塌陷结构不清与肿瘤浸润所致肺泡结构破坏、消失等改变；维多利亚蓝染液在动静脉壁、肺泡间隔以及肺组织胸膜的弹力纤维呈深蓝紫色波浪状着色，可以协助判断肺表面内外弹力纤维受破坏情况。

26、2、本方案提供的双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒，能够在一张组织切片上同时检测ck7和cd34两种抗原靶标及维多利亚蓝染色液的表达情况，不但可以大幅减少样本的使用量，而且便于观察靶标蛋白的相互关系、共生定位以及组织形态，可以有效提升病理结果的精准度，提供客观可读的数据，提高了诊断的一致性。

27、本方案提供的双重免疫组化结合弹力纤维的染色方法，使用的组合一抗无需单个顺次孵育，节约实验时间，弹力纤维染色步骤所用的染液仅为维多利亚蓝，减少实验流程，节约实验时间。

技术特征：

1.一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒，其特征在于：包括组合一抗，所述组合一抗包括不同种属的抗ck7和cd34单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒，其特征在于：所述组合一抗包括兔抗人ck7单克隆抗体和鼠抗人cd34单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒，其特征在于：还涉及以下组分：过氧化氢阻断剂、二抗试剂、dab显色液、快红系列显色剂、苏木素复染液、返蓝液、维多利亚蓝染液、95％乙醇和无水乙醇。

4.根据权利要求3所述的一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒，其特征在于：所述二抗试剂包括：

5.一种双重免疫组化结合弹力纤维的染色方法，其特征在于：对待测组织切片进行常规烤片、脱蜡水化、抗原热修复、内源性过氧化氢酶的封闭等处理，使用组合一抗对待测组织切片进行孵育，再使用二抗试剂对待测组织切片进行孵育，用相关酶标底物反应显色，然后再使用dab显色液进行孵育显色，苏木素衬染返蓝后直接使用维多利亚蓝染色，后常规脱水透明封片。

6.一种根据权利要求1至4任意一项所述的试剂盒或根据权利要求4所述的染色方法在病理组织染色及诊断中的应用。

技术总结本发明提供一种双重免疫组化结合弹力纤维染色的试剂盒、染色方法和应用。所述试剂盒包括组合一抗，所述组合一抗包括不同种属的抗CK7和CD34单克隆抗体，如兔抗人CK7单克隆抗体和鼠抗人CD34单克隆抗体。本发明通过选择CK7和CD34作为组合一抗，不仅可以准确表明肿瘤上皮的生长模式，还能明确看出肿瘤引起的肺泡间隔纤维组织增生增厚与其他因素导致的肺泡结构变化，再结合单独维多利亚蓝染色，可以清楚的看出动静脉壁和肺脏层胸膜的弹力纤维，用于判断肺表面弹力纤维的完整性，判明肿瘤浸润情况。通过上述试剂盒可以有效提升病理结果的精准度，提高肺腺癌相关病变分层诊断的一致性。技术研发人员：张锋,任兴昌受保护的技术使用者：浙江峻山生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/1