一种可募集并训练干细胞定向分化的镁离子水凝胶微球

本发明涉及生物医药，特别涉及一种可募集并训练干细胞定向分化的镁离子水凝胶微球。

背景技术：

1、骨关节炎( osteoarthritis，oa )是最常见的关节疾病之一，严重影响患者的生活质量，致残率高。oa的早期是个重要的“时间窗”，早期治疗有助于恢复关节稳态。关节软骨无血液供应，自身修复能力弱，其退变或损伤会加剧关节的炎症。目前临床尚无修复受损软骨和有效缓解oa进展的治疗手段。

2、早期oa病变局限，关节腔注射药物或生物制剂可直接将药物输送至病变部位，相对于全身给药，具有药物利用率高、减少药物全身暴露等优势。然而，药物或生物制剂易从关节腔快速清除，疗效持续时间较短，长期多次进行关节腔注射存在一定风险，如多次使用糖皮质激素有加速关节软骨量丢失的风险。将生物材料作为输送平台，提高药物及生物制剂的利用率，可有效解决上述难题。其中，水凝胶作为一种常见的生物材料，具有良好的生物相容性、药物缓释能力及仿细胞外基质功能等优势，在骨科领域发展迅速。传统块状水凝胶常需手术植入，创伤较大。此外，可注射的温敏水凝胶在注射过程会产生较大的注射压力，可能会损害正常生理组织和负载的药物或生物制剂，给患者带来不适。因此，如何对水凝胶进行优化，实现药物或生物制剂于关节腔内的有效递送，是目前亟待解决的难题。

3、微流控技术可对多个不相容的液相进行调控，从而产生大小均一、具有特定结构的微米级球状生物材料。利用微流控技术制备的水凝胶微球，不仅具备水凝胶材料和结构上的优点，其微米级粒径还有利于规避从关节腔快速清除的风险。公开号cn117338816a的专利提供了一种可负载干细胞的水凝胶微球，该微载体可负载外源性干细胞，并释放锶离子促进干细胞成骨分化以治疗骨关节炎。但诸如此类的干细胞技术应用仍存在如下难点：1、异体干细胞来源稀缺，存在免疫排斥和感染风向，自体干细胞提取需经历二次损伤；2、干细胞扩增时间较长，无法及时进行相关干预，而提前冻存干细胞会降低干细胞活力，影响回输后的效果；3、干细胞的表型在体外培养过程中难以维持，且回输过程的剪切力会损伤干细胞。

4、内源性干细胞的动员是实现早期oa受损软骨修复不可或缺的一部分，但组织的内源性修复是一个复杂的过程，干细胞的生存和分化易受局部异常微环境的影响，未经训练的干细胞较难向目标细胞和组织分化。因此，训练干细胞向软骨分化有利于实现精准内源性修复。治疗性金属离子在促进组织修复再生方面具有良好的应用前景。其中，镁离子作为人体含量最多的金属离子之一，具有良好的生物安全性，可促进成骨或软骨分化和干细胞迁移，但目前对镁离子促进成软骨的有效浓度所知甚少，且金属离子负载困难，单纯载入生物材料中释放过快。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可募集并训练干细胞定向分化的镁离子水凝胶微球，可募集内源性干细胞，并缓慢释放镁离子训练干细胞定向分化，有利于实现精准内源性修复，既可保留干细胞治疗的优势，还可避免外源性干细胞治疗技术应用的难点。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种可募集并训练干细胞定向分化的镁离子水凝胶微球，通过以下方法制备而成：

4、（1）水相制备：甲基丙烯酰化明胶、氯化镁、光引发剂及多巴胺甲基丙烯酰胺溶于去离子水形成水相；

5、（2）油相制备：表面活性剂溶于矿物油形成油相；

6、（3）微流控形成微球：水相与油相通过微流控装置制备水凝胶液滴，并在紫外光照射下交联固化形成微球，清洗干净得螯合镁离子的水凝胶微球；

7、（4）负载：将螯合镁离子的水凝胶微球冷冻干燥得冻干微球，将冻干微球加入血小板衍生生长因子-bb溶液中混匀，4℃孵育过夜，离心收集上清并用去离子水清洗后得产品。

8、本发明将pdgf-bb（血小板衍生生长因子-bb）负载于水凝胶微球中，以动员内源性干细胞，促进软骨修复。本发明通过多巴胺甲基丙烯酰胺(dopamine methacrylamide,dma) 中的邻苯二酚基团将该浓度的镁离子螯合于水凝胶微球中 ，实现镁离子的有效控释。本发明发现利用镁离子训练干细胞能够定向成软骨分化，有利于实现精准内源性修复。

9、作为优选，步骤（1）中，水相中各成分的浓度为：甲基丙烯酰化明胶45-55mg/ml，氯化镁32-38mg/ml，光引发剂4-7mg/ml，多巴胺甲基丙烯酰胺7-10mg/ml。

10、作为优选，步骤（1）中，所述光引发剂为光引发剂2959。

11、作为优选，步骤（2）中，油相中表面活性剂浓度为4-6wt%。

12、作为优选，步骤（2）中，所述表面活性剂为span 80。

13、作为优选，步骤（3）中，微流控装置中控制水相与油相的流速比为2-3:1。

14、作为优选，步骤（4）中，血小板衍生生长因子-bb溶液的浓度为180-220ng/ml。

15、作为优选，步骤（4）中，5mg冻干微球加入0.8-2ml血小板衍生生长因子-bb溶液中。

16、本发明的有益效果是：本发明可持续释放pdgf-bb（血小板衍生生长因子-bb）以募集内源性干细胞，并释放镁离子训练干细胞定向分化。其中，募集内源性干细胞进行软骨修复，既可保留干细胞治疗的优势，还可避免外源性干细胞治疗技术应用的难点。此外，利用镁离子训练干细胞向软骨分化有利于实现精准内源性修复，与肿瘤免疫治疗中的car-t疗法有异曲同工之妙。

技术特征：

1.一种可募集并训练干细胞定向分化的镁离子水凝胶微球，其特征在于，通过以下方法制备而成：

2.根据权利要求1所述的镁离子水凝胶微球，其特征在于：步骤（1）中，水相中各成分的浓度为：甲基丙烯酰化明胶45-55mg/ml，氯化镁32-38mg/ml，光引发剂4-7mg/ml，多巴胺甲基丙烯酰胺7-10mg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的镁离子水凝胶微球，其特征在于：步骤（1）中，所述光引发剂为光引发剂2959。

4.根据权利要求1所述的镁离子水凝胶微球，其特征在于：步骤（2）中，油相中表面活性剂浓度为4-6wt%。

5.根据权利要求1或4所述的镁离子水凝胶微球，其特征在于：步骤（2）中，所述表面活性剂为span 80。

6.根据权利要求1所述的镁离子水凝胶微球，其特征在于：步骤（3）中，微流控装置中控制水相与油相的流速比为2-3:1。

7.根据权利要求1所述的镁离子水凝胶微球，其特征在于：步骤（4）中，血小板衍生生长因子-bb溶液的浓度为180-220ng/ml。

8.根据权利要求1所述的镁离子水凝胶微球，其特征在于：步骤（4）中，5mg冻干微球加入0.8-2ml血小板衍生生长因子-bb溶液中。

技术总结本发明公开了一种可募集并训练干细胞定向分化的镁离子水凝胶微球，通过以下方法制备而成：（1）水相制备；（2）油相制备；（3）微流控形成微球：水相与油相通过微流控装置制备水凝胶液滴，并在紫外光照射下交联固化形成微球，清洗干净得螯合镁离子的水凝胶微球；（4）负载：将螯合镁离子的水凝胶微球冷冻干燥得冻干微球，将冻干微球加入血小板衍生生长因子‑BB溶液中混匀，4℃孵育过夜，收集上清并用去离子水清洗后得产品。本发明可募集内源性干细胞，并缓慢释放镁离子训练干细胞定向分化，有利于实现精准内源性修复，既可保留干细胞治疗的优势，还可避免外源性干细胞治疗技术应用的难点。技术研发人员：彭兆祥,俞涵,陈剑平,陈宇炯受保护的技术使用者：宁波市医疗中心李惠利医院（宁波大学附属李惠利医院）技术研发日：技术公布日：2024/8/5