一种用于普瑞巴林手性中间体合成的固定化腈水解酶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及固定化酶，尤其涉及一种用于普瑞巴林手性中间体合成的固定化腈水解酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、普瑞巴林(pregabalin)化学名称(s)-3-氨甲基-5-甲基己酸，分子式为c8h17no2，是一种γ-氨基丁酸(gaba)类似物，能够竞争性地结合gaba受体，抑制兴奋传导，因而具有抗癫痫、抗惊厥、镇痛和抗焦虑活性。

2、普瑞巴林的化学-酶法合成具体过程如下：先在腈水解酶的催化下，将外消旋的异丁基丁二腈(3-氰基-5-甲基己腈)选择性地水解为手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸；而后在ni催化剂的作用下，(s)-3-氰基-5-甲基己酸发生加氢还原，转化为普瑞巴林；在腈水解的过程中，未参与反应的(r)-3-氰基-5-甲基己腈可在碱催化剂作用下外消旋化，再次进行腈水解反应。

3、在手性中间体的酶法合成过程中，游离的腈水解酶在完成反应后，无法从反应体系中分离出来，难以实现回收利用，且酶活性易受到外界环境的影响。采用能够表达腈水解酶的细胞或者固定化细胞参与反应，能够解决腈水解酶的回收利用问题，并减弱外界环境对酶活性的影响，但底物和产物需要进行跨膜运输，造成反应速率较低，并且，细胞的刚性较低，易破碎释放腈水解酶，故多次使用后酶活保留率较低。

4、相对比而言，采用载体对腈水解酶进行固定化，有利于实现更高的酶催化反应速率以及更好的酶重复使用性能。金属有机框架(mof)具有较大的比表面积和孔隙率，同时还具备一定的刚性，其作为固定化酶载体，近年来受到了研究者们越来越多的关注。利用戊二醛等桥连剂将酶共价连接到mof上，是mof固定化酶的一种常用方法(如专利cn116656647a)，该方法利用共价连接的方式，能够使酶与mof之间具有较高的结合牢固性，减少多次使用过程中酶的脱落，从而使固定化酶能够保持较高的催化活性，但现有的在mof与酶之间形成共价连接的方式存在以下问题：mof上所连接的酶的自由度较低，且其与mof之间的结合较为紧密，不利于底物和产物在其间扩散，这会造成固定化酶的催化活性较低。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，即现有的采用共价结合法制备的mof固定化酶，虽然具有较好的重复使用性能，但催化活性较低，本发明提供了一种用于普瑞巴林手性中间体合成的固定化腈水解酶的制备方法。采用该制备方法，能够使得到的固定化腈水解酶具有较高的催化活性，且在多次使用后酶活保留率较高。

2、本发明的具体技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种用于普瑞巴林手性中间体合成的固定化腈水解酶的制备方法，包括以下步骤：

4、s1：通过氨基与环氧基之间的开环反应，将α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇接枝到带有氨基的金属有机框架上，获得cooh-peg-mof；

5、s2：通过氮丙啶交联剂与羧基之间的反应，在腈水解酶与cooh-peg-mof之间形成共价连接，获得固定化腈水解酶。

6、本发明制备固定化腈水解酶的机理如下：在步骤s1中，α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇(cooh-peg-epo)中一段的环氧基(缩水甘油基)与带有氨基的金属有机框架(mof-nh2)中的氨基发生开环反应，制得的产物cooh-peg-mof中，mof上连接有peg，且peg链的自由端连接有羧基；在步骤s2中，腈水解酶和cooh-peg-mof中的羧基与氮丙啶交联剂发生反应，从而形成交联，实现腈水解酶的固定化。

7、通过上述方法制得的固定化腈水解酶中，酶与mof之间通过cooh-peg-epo和氮丙啶交联剂实现共价连接。利用共价连接的方式，能够确保酶与载体之间的结合牢固性，以确保多次使用后的酶活保留率；同时，其中的聚乙二醇(peg)链段具有较高的柔性，能够使负载在mof中的酶具有较高的自由度，并使酶与mof之间存在较大的空隙以便于底物和产物的扩散，有利于减小腈水解酶固定化后酶活下降的幅度。

8、作为优选，步骤s1的具体过程包括：将带有氨基的金属有机框架和α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇分散在反应溶剂b中，进行开环反应，分离出产物，获得cooh-peg-mof。

9、进一步地，步骤s1中，所述开环反应的过程中，反应体系的初始ph为8～9，反应温度为30～40℃，反应时间8～12h。

10、进一步地，步骤s1中，所述带有氨基的金属有机框架与反应溶剂b的质量体积比为1g：100～250ml。

11、作为优选，步骤s1中，所述α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇中，聚乙二醇的重均分子量为500～2000。

12、通过将peg链段的重均分子量控制在500～2000范围内，有利于提高腈水解酶的自由度，以及增大酶与mof之间的空隙，从而进一步提高固定化腈水解酶的催化活性。

13、作为优选，步骤s1中，所述带有氨基的金属有机框架与α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇的质量比为1：0.1～0.3。

14、作为优选，步骤s1中，所述开环反应在惰性气体保护下或在真空条件下进行。

15、作为优选，步骤s1中，所述带有氨基的金属有机框架的制备方法包括以下步骤：将摩尔比为1：2.5～5.5的2-氨基对苯二甲酸和对甲基苯甲酸分散到反应溶剂a中，加入锆盐，进行晶化反应，分离出产物，获得带有氨基的金属有机框架。

16、在上述制备过程中，采用2-氨基对苯二甲酸作为羧酸配体，能够在mof上引入氨基，为cooh-peg-epo提供接枝位点。

17、并且，通过上述方法能够制得uio-66-nh2，其具有较好的耐酸性和耐碱性，因而能够较好地适应于普瑞巴林手性中间体合成过程中的ph环境。

18、此外，在mof骨架形成和生长的过程中，当连接上对甲基苯甲酸时，由于其中仅存在一个羧基，因而能够起到封端效果，使骨架停止生长，从而形成缺陷，通过这种方式，能够使所制得的mof中具有较大的孔径，有助于提高比表面积，增加酶负载量，同时还能使mof内的底物和产物易于扩散，因而有助于减小固定化后的酶活下降幅度。

19、进一步地，所述晶化反应的温度为120～130℃，时间为20～30h。

20、进一步地，所述锆盐的摩尔量与2-氨基对苯二甲酸和对甲基苯甲酸的总摩尔量之比为1：0.8～1.2。

21、进一步地，所述2-氨基对苯二甲酸和对甲基苯甲酸的总质量与反应溶剂a的体积之比为1g：15～20ml。

22、作为优选，步骤s2的具体过程包括：将cooh-peg-mof分散到反应溶剂c中，加入氮丙啶交联剂，进行第一次反应，而后加入腈水解酶酶液，进行第二次反应，分离出产物获得固定化腈水解酶。

23、进一步地，步骤s2中，所述第一次反应的温度为20～30℃，时间为2～3h；所述第二次反应的温度为20～30℃，时间为4～6h。

24、进一步地，步骤s2中，所述cooh-peg-mof与反应溶剂c的质量体积比为1g：200～300ml。

25、作为优选，步骤s2中，所述cooh-peg-mof、腈水解酶和氮丙啶交联剂的质量比为1：0.05～0.2：0.1～0.3。

26、第二方面，本发明提供了一种用于普瑞巴林手性中间体合成的固定化腈水解酶，所述固定化腈水解酶采用所述制备方法制得。

27、第三方面，本发明提供了所述固定化腈水解酶在普瑞巴林手性中间体合成中的应用，所述固定化腈水解酶用于催化异丁基丁二腈转化为(s)-3-氰基-5-甲基己酸。

28、利用本发明的固定化腈水解酶催化普瑞巴林手性中间体合成，能够实现较高的反应速率，且反应完成后酶能够回收利用，在多次使用后仍能保持较高的催化活性。

29、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

30、(1)本发明在制备固定化腈水解酶的过程中，采用cooh-peg-epo和氮丙啶交联剂在酶与mof之间形成共价连接，能够使酶与mof之间具有较高的结合强度，同时还能使酶具有较高的自由度，并使底物和产物易于在酶与mof之间的空隙中扩散，因而能够较好地兼顾固定化后的酶活和重复使用性能。

31、(2)本发明采用特定方法制备带有氨基的金属有机框架，能够使其具有较好的耐酸耐碱性，有助于固定化腈水解酶适应普瑞巴林手性中间体合成过程中的ph环境，此外还能减小固定化后的酶活下降幅度。

32、具体实施方式

33、下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

34、总实施例

35、一种用于普瑞巴林手性中间体合成的固定化腈水解酶的制备方法，包括以下步骤：

36、s1：通过氨基与环氧基之间的开环反应，将α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇接枝到带有氨基的金属有机框架上，获得cooh-peg-mof；

37、s2：通过氮丙啶交联剂与羧基之间的反应，在腈水解酶与cooh-peg-mof之间形成共价连接，获得固定化腈水解酶。

38、作为一种具体实施方式，步骤s1的具体过程包括：将带有氨基的金属有机框架和α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇分散在反应溶剂b中，调节ph至8～9，30～40℃开环反应8～12h，分离出产物，获得cooh-peg-mof。

39、作为一种具体实施方式，步骤s1中，所述α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇中，聚乙二醇的重均分子量为500～2000。

40、作为一种具体实施方式，步骤s1中，所述带有氨基的金属有机框架、α-羧基-ω-缩水甘油基聚乙二醇和反应溶剂b的质量体积比为1g：0.1～0.3g：100～250ml。

41、作为一种具体实施方式，步骤s1中，所述开环反应在惰性气体保护下或在真空条件下进行。

42、作为一种具体实施方式，步骤s1中，所述带有氨基的金属有机框架的制备方法包括以下步骤：将摩尔比为1：2.5～5.5的2-氨基对苯二甲酸和对甲基苯甲酸分散到反应溶剂a中，加入锆盐，所述锆盐的摩尔量与2-氨基对苯二甲酸和对甲基苯甲酸的总摩尔量之比为1：0.8～1.2，120～130℃晶化反应20～30h，分离出产物，获得带有氨基的金属有机框架。

43、作为一种具体实施方式，步骤s2的具体过程包括：将cooh-peg-mof分散到反应溶剂c中，加入氮丙啶交联剂，20～30℃反应2～3h，而后加入腈水解酶酶液，20～30℃反应4～6h，分离出产物获得固定化腈水解酶。

44、作为一种具体实施方式，步骤s2中，所述cooh-peg-mof、腈水解酶、氮丙啶交联剂和反应溶剂c的质量体积比为1g：0.05～0.2g：0.1～0.3g：200～300ml。

45、一种用于普瑞巴林手性中间体合成的固定化腈水解酶，所述固定化腈水解酶采用上述制备方法制得。

46、上述固定化腈水解酶在普瑞巴林手性中间体合成中的应用，所述固定化腈水解酶用于催化异丁基丁二腈转化为(s)-3-氰基-5-甲基己酸。