一种靶向RP1L1基因的sgRNA导向序列及其应用

本发明涉及基因编辑，更具体地说，它涉及一种靶向rp1l1基因的sgrna导向序列及其应用。

背景技术：

1、隐匿性黄斑营养不良(occult macular dystrophy,omd)，是一种视锥细胞受损相关的黄斑营养不良，通常呈常染色体显性遗传。omd典型特征为双眼视力进行性下降，多数在青中年发病，10-15年内视力下降较快，达低视力水平。眼底镜检查未见无明显异常，全视野视网膜电图在正常范围，光学相干断层扫描黄斑区椭圆体带和嵌合体带模糊或消失，视野出现中心暗点和多局部视网膜电中央区反应振幅密度降低，黄斑区视觉功能受损。

2、视网膜色素变性1-相似1基因(retinitis pigmentosa 1-like 1,rp1l1)为常染色体显性遗传omd的主要致病基因，rp1l1相关omd又被称为miyake病。rp1l1位于8p23.1，由4个外显子组成，形成最短、最常见的mrna可编码一种2,400个氨基酸的光感受器特异蛋白rp1l1，其n-端350个氨基酸与rp1高度同源，在氨基酸33-133和147-228分别含有两个双皮质素(doublecortin,dcx)结构域，在氨基酸307-340处包含一个rp1结构域，c-端氨基酸序列与其他蛋白差异较大。

3、omd的最主要致病位点为：rp1l1 c.133c>t,p.r45w，在miyake病患者中占近70％。通过基因型-表型关联分析发现，携带热点突变rp1l1 c.133c>t,p.r45w患者相较于第二个热点突变区域或其他位点突变的患者，发病更早且表型更重。r45w_omd患者中位发病年龄为14岁，明显早于omd患者整体中位发病年龄(30岁)，且视力受损更严重，视野通常出现中心暗点，影像检查发现感光细胞破坏常双眼对称出现且易累及外界膜，且此类病人病情进展更显著。

4、综上所述，热点错义突变位点rp1l1 c.133c>t,p.r45w作为常染色体显性遗传omd的主要病因，致病率最高，所致表型更严重，作为omd疾病治疗和疾病致病机制研究的重要靶点，目前，暂时没有与omd疾病相关治疗研究，或者与rp1l1基因相关基因编辑研究。因此，本发明旨在提供一种靶向rp1l1基因的sgrna导向序列及其应用，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述问题，提供了一种靶向rp1l1基因的sgrna导向序列及其应用，本发明针对热点突变c.133c>t，设计靶向热点突变的sgrna，所构成的crispr/cas9系统能够靶向编辑突变序列，同时能介导同源重组，使突变序列修正为正常序列。可将此sgrna作为后续基因编辑的高效导向序列，使其应用在rp1l1基因相关致病机制研究、细胞和动物模型构建、疾病的药物研发等多个领域。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：所述sgrna的核苷酸序列如seq idno：1所示。

3、本发明进一步设置为：所述sgrna加上骨架序列并通过2'-o-甲基化修饰和硫代修饰制备得到sgrna1，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述骨架核苷酸序列如seq id no：3所示。

4、本发明还提供了一种靶向rp1l1基因的sgrna导向序列在基因编辑中的应用。

5、以下为本发明方案涉及的序列：

6、seq id no：1(sgrna的核苷酸序列)：

7、5’-accaaacgaccccaggcgga-3’。

8、seq id no：2(sgrna1的核苷酸序列)：

9、ma*mg*mg*cggaccccagcaaaccaguuuuagamgmcm umamgmamamamumamgmcaaguuaaaauaaggcuagucc guuaucamamcmumumgmamamamamamgmumgmgmcmamcmcmgmamgmumcmgmgmumgmcmu*mu*mu*mu。

10、seq id no：3(骨架的核苷酸序列)：

11、guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuag uccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuu u。

12、seq id no：4(mrna的核苷酸序列)：

13、auggacaagaaguacagcaucggacuggacaucggaacaaacagcgucggaugggcagucaucacagacgaauacaaggucccgagcaagaaguucaagguccugggaaacacagacagacacagcaucaagaagaaccugaucggagcacugcuguucgacagcggagaaacagcagaagcaacaagacugaagagaacagcaagaagaagauacacaagaagaaagaacagaaucugcuaccugcaggaaaucuucagcaacgaaauggcaaaggucgacgacagcuucuuccacagacuggaagaaagcuuccuggucgaagaagacaagaagcacgaaagacacccgaucuucggaaacaucgucgacgaagucgcauaccacgaaaaguacccgacaaucuaccaccugagaaagaagcuggucgacagcacagacaaggcagaccugagacugaucuaccuggcacuggcacacaugaucaaguucagaggacacuuccugaucgaaggcgaccugaacccggacaacagcgacgucgacaagcuguucauccagcugguccagacauacaaccagcuguucgaagaaaacccgaucaacgcaagcggagucgacgcaaaggcaauccugagcgcaagacugagcaagagcagaagacuggaaaaccugaucgcacagcugccgggagaaaagaagaacggacuguucggaaaccugaucgcacugagccugggacugacaccgaacuucaagagcaacuucgaccuggcagaagacgcaaagcugcagcugagcaaggacacauacgacgacgaccuggacaaccugcuggcacagaucggcgaccaguacgcagaccuguuccuggcagcaaagaaccugagcgacgcaauccugcugagcgacauccugagagucaacacagaaaucacaaaggcaccgcugagcgcaagcaugaucaagagauacgacgaacaccaccaggaccugacacugcugaaggcacuggucagacagcagcugccggaaaaguacaaggaaaucuucuucgaccagagcaagaacggauacgcaggauacaucgacggaggagcaagccaggaagaauucuacaaguucaucaagccgauccuggaaaagauggacggaacagaagaacugcuggucaagcugaacagagaagaccugcugagaaagcagagaacauucgacaacggaagcaucccgcaccagauccaccugggagaacugcacgcaauccugagaagacaggaagacuucuacccguuccugaaggacaacagagaaaagaucgaaaagauccugacauucagaaucccguacuacgucggaccgcuggcaagaggaaacagcagauucgcauggaugacaagaaagagcgaagaaacaaucacaccguggaacuucgaagaagucgucgacaagggagcaagcgcacagagcuucaucgaaagaaugacaaacuucgacaagaaccugccgaacgaaaagguccugccgaagcacagccugcuguacgaauacuucacagucuacaacgaacugacaaaggucaaguacgucacagaaggaaugagaaagccggcauuccugagcggagaacagaagaaggcaaucgucgaccugcuguucaagacaaacagaaaggucacagucaagcagcugaaggaagacuacuucaagaagaucgaaugcuucgacagcgucgaaaucagcggagucgaagacagauucaacgcaagccugggaacauaccacgaccugcugaagaucaucaaggacaaggacuuccuggacaacgaagaaaacgaagacauccuggaagacaucguccugacacugacacuguucgaagacagagaaaugaucgaagaaagacugaagacauacgcacaccuguucgacgacaaggucaugaagcagcugaagagaagaagauacacaggauggggaagacugagcagaaagcugaucaacggaaucagagacaagcagagcggaaagacaauccuggacuuccu。

14、seq id no：5：

15、rp1l1-f:caggccccgagccaccgtgagt。

16、seq id no：6：

17、rp1l1-r:aggctatgcaggccccggggtg。

18、与现有技术相比，本方案的有益效果：

19、本发明设计的sgrna所构成的crispr/cas9对突变序列编辑率高达98.26±0.44％，且在未提供外源修复模板的情况下，以野生型正常序列为模板，通过同源重组将突变序列中约40％成功编辑修复为正常序列，使正常的野生型序列比例从原有的50％提高到71.17±5.44％；同时本发明针对热点突变作为靶点，设计靶向热点突变的sgrna，通过将sgrna作为后续基因编辑的高效导向序列，使其能够在rp1l1基因相关致病机制研究、细胞和动物模型构建、疾病的药物研发等多个领域进行应用。