用于燕麦品种区别鉴定的KASP引物组及其方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种用于燕麦品种区别鉴定的kasp引物组及其方法。

背景技术：

1、燕麦(avena sativa.l)是禾本科燕麦属一年生草本植物，是我国乃至全世界重要的粮饲作物。燕麦具有耐瘠薄、耐盐碱耐严寒等多种耐极端环境的突出特点，具有较好的适应性，可大范围推广种植。目前世界上约有73％的燕麦作为家畜的饲料和饲草，12％的燕麦被加工成营养食品，15％的燕麦作为种子和应用于工业生产。谷物燕麦具有高蛋白质和高可溶性膳食纤维含量，且有降低血浆胆固醇水平的功效。饲用燕麦具有产量高、营养价值高、适口性好、消化率高、适于青贮和调制干草等诸多优点，能够起到保护草地资源，促进草地畜牧业和生态环境可持续发展的关键。随着我国国民经济水平的快速发展，燕麦已发展成为重要的粮饲兼用作物，燕麦种植面积也随之增加，燕麦育种逐渐得到重视。然而不同地区引种频繁，加上选育新品种不断增加，导致国内种子市场出现同名异种和同种异名的现象，极大增加燕麦品种鉴定的难度。

2、燕麦是异源六倍体植物，基因组大，杂合度高，遗传背景复杂，分子生物学研究水平远落后于大豆、水稻等其他主要作物。目前，可用于燕麦品种鉴定的分子标记还停留以简单重复序列(simple sequence repeat,ssr)和相关序列扩增多态性标记(sequence-related amplified polymorphism，srap)等为代表的第一、二代分子标记技术。随着测序技术的迅速发展，第三代单核苷酸多态性分子标记发展迅速。其中，竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele-specific pcr,kasp)技术是基于snp标记进一步开发的第三代分子标记，适用于多样本、少位点的检测，具有高效、灵活、准确、低成本的特点，是国际植物新品种保护联盟(upov)推荐使用的于品种鉴定的有效方法之一，已经广泛运用于作物基因分型和品种鉴定。

3、明确燕麦种质资源遗传背景是燕麦生产、新品种选育的重要物质基础。近年来，由于引进和选育燕麦新品种逐渐增多，时常出现“套牌”现象，严重损害了育种者和育种单位的合法权益。现有燕麦种质资源鉴定存在分子标记少、操作复杂、实验成本高等问题，其准确性较差且效率较低。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种能够准确、高效的用于燕麦品种区别鉴定的kasp引物组。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该用于燕麦品种区别鉴定的kasp引物组，包括14组引物，其核苷酸序列如序列表seq no.1～42所示。

3、本发明还提供了一种利用上述kasp引物组用于燕麦品种区别鉴定的方法，该用于燕麦品种区别鉴定的方法，首先，确定需要区别鉴定的每个燕麦样品如下表1所述的14个核心snp位点的基因类型；

4、表1

5、 编号 染色体 位置 等位基因 snp001 chr1a 470340330 a/g snp002 chr1a 522141358 g/a snp004 chr1c 124470216 c/a snp011 chr2c 391190085 t/c snp026 chr4c 568169579 c/g snp032 chr5a 5982753 c/t snp036 chr5d 479869477 a/t snp042 chr6c 71768764 a/g snp043 chr6c 76074537 a/g snp044 chr6c 314610691 a/t snp046 chr6d 281086255 a/g snp050 chr7c 97734082 c/g snp051 chr7c 151602286 t/c snp052 chr7c 506017835 g/t

6、利用如下方法确定需要区别鉴定的每个燕麦样品如上表1所述的14个核心snp位点的基因类型，具体包括如下步骤：

7、a、提取待测燕麦样品基因组dna；

8、b、以步骤a提取的待测样品dna为模板，利用序列表seq no.1～42所示引物进行pcr扩增；

9、c、在pcr扩增完成后，利用intelliqube机器进行荧光数据读取和分析得到燕麦样品的14个核心snp位点的基因类型；

10、接着，将需要区别鉴定的每个燕麦样品的14个核心snp位点的基因类型两两之间进行比对，若进行对比的两个燕麦样品的14个核心snp位点的基因类型均相同，则认定比对的两个燕麦属于同一个品种的燕麦，若进行对比的两个燕麦样品的14个核心snp位点的基因类型不相同，则认定比对的两个燕麦不属于同一个品种的燕麦。

11、进一步的是，在步骤a中，提取待测燕麦样品基因组dna的具体方法如下所述：将燕麦叶片样本切碎放入2ml离心管中并冷冻在液氮中，加入直径约4mm左右的钢珠，液氮中充分冷冻后,用组织研磨仪将样品磨成粉末状；粉状样品加入ctab提取缓冲液中，加热样品，使细胞溶解并释放dna，12000×g 4℃离心10分钟；取上清液加入氯仿，充分混匀后12000×g 4℃离心10分钟；取上清液并转移至新的离心管，加入2/3体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置30分钟12000×g 4℃离心10分钟，弃上清；加入1ml预冷的75％乙醇，摇匀、漂洗、沉淀、12000×g 4℃离心10分钟，弃上清；使用nanopor分光光度仪检测dna浓度，浓度合格的dna，-20℃冻存备用。

12、进一步的是，在步骤b中，所述pcr扩增反应体系总体积为5μl，其中包括1.25μl浓度为10ng/μl的模板dna，2.5μl的kasp master mix，0.5μl浓度为0.5μm的正向引物，0.5μl浓度为0.5μm的反向引物，0.25μl浓度为0.5μm的通用引物。

13、进一步的是，在步骤b中，所述pcr扩增程序为：95℃预变性10分钟；然后95℃变性20s、55-61℃退火60s、72℃延伸5min共进行10个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。

14、进一步的是，在步骤c中，荧光fam激发(nm)485，发射(nm)520；hex激发535，发射556，rox激发575，发射610。

15、本发明的有益效果在于：通过本发明所述的14组引物能够准确、高效的确定燕麦样品的14个核心snp位点的基因类型；将需要区别鉴定的每个燕麦样品的14个核心snp位点的基因类型两两之间进行比对，若进行对比的两个燕麦样品的14个核心snp位点的基因类型均相同，则认定比对的两个燕麦属于同一个品种的燕麦，若进行对比的两个燕麦样品的14个核心snp位点的基因类型不相同，则认定比对的两个燕麦不属于同一个品种的燕麦，从而减少不合格种子混入市场造成巨大的经济损失，同时对于燕麦品种鉴定和保护具有重要意义。