EsSPL6基因及其功能验证方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种esspl6基因及其功能验证方法和应用。

背景技术：

1、老芒麦(elymus sibiricus l.)是披碱草属(elymus l.)的模式物种，是一种多年生疏丛型中旱生植物，异源四倍体(基因组为ststhh，2n＝4x＝28)。它是欧亚大陆干旱半干旱温带地区的广布种，在我国主要分布于青藏高原、新疆、甘肃、内蒙古等地区。老芒麦抗寒性强，居于高产、易栽培的特性，是青藏高原地区产量最高的多年生牧草，且粗蛋白含量高、适口性好，在草甸草原植物群落中能够形成优势种或建群种，广泛用于放牧、栽培草地建植、草地恢复重建等，是青藏高原高寒草甸草原区利用最为广泛的当家草种之一。干旱是全球危害最严重的自然灾害之一，对植物生长和产量的危害最大，已经成为了制约现代农业发展和影响植物生长发育的重要问题。青藏高原具有典型的干旱、寒冷气候特征，随着气候变化，其干旱化趋势愈加显现，导致青藏高原地区草地持续沙化、退化，牧草产量和草地生产力严重下降，“缺草”已经成为青藏高原地区草地畜牧业健康发展的瓶颈。因此，了解老芒麦等披碱草属牧草的抗旱生理和遗传基础，进而培育高抗旱型老芒麦新品种，不仅可提高青藏高原栽培优质牧草产量和种子产量，而且能作为固沙固土植物用于改良沙化和板结草地，对于该地区生态保护亦有重要意义。

2、转录因子是一类可通过识别结构基因启动子中特异的顺式作用元件而调节结构基因转录的调控因子，spl转录因子参与调节各种非生物胁迫，并通过在非生物胁迫期间上调或下调下游靶基因的表达而充当转录激活因子或抑制因子，从而导致胁迫耐受性或胁迫敏感性表型，老芒麦发生干旱胁迫受内在转录因子调控。探究干旱胁迫的内在调控机制具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高老芒麦抗旱性的esspl6基因。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该esspl6基因的编码区序列如序列表seq id no.1所示。

3、本发明还提供了一种esspl6基因的功能验证方法，其功能验证方法包括以下步骤：

4、1)、将esspl6基因的编码区序列克隆到植物表达载体pcambia1300s中生成过表达载体pcambia1300s-esspl6，esspl6基因的编码区序列如seq id no.1所示；通过农杆菌介导将过表达载体pcambia1300s-esspl6转化到哥伦比亚野生型拟南芥中；通过抗性筛选阳性转化体，并通过rt-qpcr检测esspl6表达筛选得到转化的esspl6过表达株系；

5、2)、将转化的esspl6过表达株系作为实验材料，野生型的拟南芥株系作为对照材料，将实验材料和对照材料进行干旱胁迫，评估比较实验材料和对照材料受干旱胁迫的程度的指标，验证esspl6基因是否对于老芒麦抗旱性具有调控作用。

6、进一步的是，在步骤1)中采用同源重组法将esspl6基因的编码区序列克隆到植物表达载体pcambia1300s生成过表达载体pcambia1300s-esspl6，其中，正向引物序列为atggagtggacggccccg；反向引物序列为tcaattcatccggtttacgcc。

7、进一步的是，在步骤1)中，通过农杆菌介导将过表达载体pcambia1300s-esspl6转化到哥伦比亚野生型拟南芥中的具体过程如下所述：首先，将阳性农杆菌菌液接种到150ml含50μg/ml kan和25μg/mlrif的yeb液体培养基中扩大培养，于28℃、200rpm摇床中过夜震荡，培养至od600＝0.8～1.0；4500rpm离心10min，收集菌体，去上清；使用拟南芥转化液(5％蔗糖溶液+0.02％sillwett-77活性剂+100乙酰丁香酮as)重悬菌体，调节od600至0.8～1.0；将正在抽薹开花的拟南芥花序浸没在侵染液中20s左右，侵染后暗培养24h，然后转入正常光照下培养，7d后重复上述侵染步骤，共侵染3次；正常培养并收集t0代种子，干燥后低温保存。

8、进一步的是，在步骤1)中，所述拟南芥转化液由5％蔗糖溶液、0.02％sillwett-77活性剂、100乙酰丁香酮as组成。

9、进一步的是，在步骤1)中，通过抗性筛选阳性转化体的具体过程如下所述：将t0代种子消毒处理后播种于含潮霉素的1/2ms固体培养基中，4℃春化2d，于正常条件下培养待发芽；将正常生长的阳性苗转移至营养土中培养并收集t1代种子；按上述方法进行连续单株收种，并筛选培养后，直至获得纯和株系的t3代种子。

10、进一步的是，在步骤2)中，将实验材料和对照材料进行干旱胁迫的处理方式如下：在老芒麦萌发期干旱胁迫处理方式为200mm甘露醇，在苗期干旱胁迫处理方式为自然干旱3周。

11、进一步的是，在步骤2)中，评估比较实验材料和对照材料受干旱胁迫的程度的指标包括：外观性状、相对含水量、超氧阴离子相对电导率、丙二醛含量、过氧化氢含量、o2-含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、游离脯氨酸含量以及萌发期的根长。

12、本发明还发现esspl6基因在提高老芒麦抗旱性中的应用。

13、本发明的有益效果在于：本发明所述的esspl6基因具有正调控植物抗旱性的功能，为抗旱型老芒麦优良品种选育、了解植物抗旱机理等研究方向提供科学依据和新材料；另外，本发明提供的esspl6基因的功能验证方法从老芒麦干旱胁迫的内在调控机制入手应用转基因拟南芥进行功能验证，具有研究深度和广度，技术效果明显，能够获得意向表型的植物株系；且采用多种评估干旱胁迫程度的指标，具有很好的评估效果，各指标相互验证，构建了科学的评估体系，该评估体系包括干旱相关关键指标：外观性状、相对含水量、超氧阴离子相对电导率、丙二醛含量、过氧化氢含量、o2-含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、游离脯氨酸含量以及萌发期的根长，均能反映植物干旱胁迫程度，可以准确的对esspl6基因的功能进行验证，经过验证，本发明所述的esspl6基因对于老芒麦抗旱性具有正调控作用，可以显著提高老芒麦的抗旱性以及干旱胁迫的抵御能力。

技术特征：

1.esspl6基因，其特征在于：esspl6基因的编码区序列如序列表seq id no.1所示。

2.一种esspl6基因的功能验证方法，其特征在于包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的esspl6基因的功能验证方法，其特征在于：在步骤1)中采用同源重组法将esspl6基因的编码区序列克隆到植物表达载体pcambia1300s生成过表达载体pcambia1300s-esspl6，其中，正向引物序列为atggagtggacggccccg；反向引物序列为tcaattcatccggtttacgcc。

4.根据权利要求2所述的esspl6基因的功能验证方法，其特征在于：在步骤1)中，通过农杆菌介导将过表达载体pcambia1300s-esspl6转化到哥伦比亚野生型拟南芥中的具体过程如下所述：首先，将阳性农杆菌菌液接种到150ml含50μg/ml kan和25μg/mlrif的yeb液体培养基中扩大培养，于28℃、200rpm摇床中过夜震荡，培养至od600＝0.8～1.0；4500rpm离心10min，收集菌体，去上清；使用拟南芥转化液(5％蔗糖溶液+0.02％sillwett-77活性剂+100乙酰丁香酮as)重悬菌体，调节od600至0.8～1.0；将正在抽薹开花的拟南芥花序浸没在侵染液中20s左右，侵染后暗培养24h，然后转入正常光照下培养，7d后重复上述侵染步骤，共侵染3次；正常培养并收集t0代种子，干燥后低温保存。

5.根据权利要求2所述的esspl6基因的功能验证方法，其特征在于：在步骤1)中，所述拟南芥转化液由5％蔗糖溶液、0.02％sillwett-77活性剂、100乙酰丁香酮as组成。

6.根据权利要求2所述的esspl6基因的功能验证方法，其特征在于：在步骤1)中，通过抗性筛选阳性转化体的具体过程如下所述：将t0代种子消毒处理后播种于含潮霉素的1/2ms固体培养基中，4℃春化2d，于正常条件下培养待发芽；将正常生长的阳性苗转移至营养土中培养并收集t1代种子；按上述方法进行连续单株收种，并筛选培养后，直至获得纯和株系的t3代种子。

7.根据权利要求2所述的esspl6基因的功能验证方法，其特征在于：在步骤2)中，将实验材料和对照材料进行干旱胁迫的处理方式如下：在老芒麦萌发期干旱胁迫处理方式为200mm甘露醇，在苗期干旱胁迫处理方式为自然干旱3周。

8.根据权利要求2所述的esspl6基因的功能验证方法，其特征在于：在步骤2)中，评估比较实验材料和对照材料受干旱胁迫的程度的指标包括：外观性状、相对含水量、超氧阴离子相对电导率、丙二醛含量、过氧化氢含量、o2-含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、游离脯氨酸含量以及萌发期的根长。

9.esspl6基因在提高老芒麦抗旱性中的应用。

技术总结本发明公开了提供一种能够提高老芒麦抗旱性的EsSPL6基因。该EsSPL6基因具有正调控植物抗旱性的功能，为抗旱型老芒麦优良品种选育、了解植物抗旱机理等研究方向提供科学依据和新材料；另外，本发明提供了EsSPL6基因的功能验证方法从老芒麦干旱胁迫的内在调控机制入手应用转基因拟南芥进行功能验证，具有研究深度和广度，技术效果明显，能够获得意向表型的植物株系；且采用多种评估干旱胁迫程度的指标，具有很好的评估效果，各指标相互验证，构建了科学的评估体系，可以准确的对EsSPL6基因的功能进行验证，经过验证，所述的EsSPL6基因对于老芒麦抗旱性具有正调控作用，可以显著提高老芒麦的抗旱性以及干旱胁迫的抵御能力。适合在生物技术领域推广运用。技术研发人员：熊艳丽,马啸,熊毅,李达旭,赵俊茗受保护的技术使用者：四川农业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16