一种包含第一材料和第二材料的微球的制作方法

本发明涉及一种微球，其包含第一材料、优选第一聚合物以及第二材料、优选第二聚合物。本发明还涉及包含多个所述微球的液相。此外，本发明涉及从样品中捕获核酸的方法和从样品中扩增核酸的方法。本发明还涉及多个微球在检测多种核酸分析物的测定中的用途。此外，本发明涉及多个微球在检测多个样品中的单个核酸分析物的测定中的用途。

背景技术：

1、壳聚糖已被用作在水性体系(cao et al.2006,anal.chem.,vol.78.pp.7222-7228)中捕获dna的聚合物。使用具有涂覆有壳聚糖聚合物的通道的微芯片来建立dna的完全水性纯化方案。类似的方案也成功地用于rna(hagan et al.2009,anal.chem.,vol.81,pp.5249-5256；和zhu et al.,2020,micromaschines,vol.11,p.186,doi:io.339o/mino2oi86)。壳聚糖涂覆的尼龙膜已被证明是用于从高度稀释的溶液中富集dna并随后在膜上进行原位pcr的合适的基质(schlappi et al.,2016,anal.chem.,vol.88,pp.7647-7653)。国际专利申请wo 2021/122563和wo 2021/122579中描述了包含琼脂糖和非交联明胶的微球。

2、在本领域中需要允许有效捕获和/或扩增核酸的改进的纳米反应器珠粒。本领域还需要更易于处理并且特别适用于捕获和/或扩增方案的改进的珠粒。此外，本领域还需要提供通用的改进的珠粒，例如用于涉及多种分析物和/或多种样品的多重测定。此外，本领域需要提供更容易单独定位和/或识别和/或确定它们是否已经与其他珠粒融合的改进珠粒，特别是在数字扩增和/或检测过程期间。此外，本领域需要提供允许经由不同的检测通道识别和/或检测多个不同珠粒的改进的珠粒。

技术实现思路

1、在第一方面，本发明涉及一种微球，其包含第一材料和第二材料，其中所述第一材料在暴露于或包含水性溶液时能够形成多孔水凝胶，并且具有在40℃至90℃范围内的熔融温度；并且其中所述第二材料在所述多孔水凝胶内形成网络，或者其中所述第二材料附接至所述第一材料并且两种材料一起在所述多孔水凝胶内形成网络；其中所述第二材料具有pka值并且能够在ph≥所述pka值的水性环境中沉淀；其中所述网络在暴露于≥所述第一材料的所述熔融温度的温度时能够收缩；所述微球还包含a)荧光标记物和b)磁性颗粒中的至少一种。

2、在一个实施方案中，所述第一材料是第一聚合物，并且其中所述第二材料是第二聚合物、低聚物或单体；其中

3、-若所述第二材料是第二聚合物，则所述第二聚合物是自身交联的聚合物或与所述第一聚合物交联的聚合物；

4、-若所述第二材料是低聚物或单体，则所述低聚物或所述单体附接至所述第一聚合物。

5、在一个实施方案中，所述第二材料、优选所述第二聚合物或所述低聚物或所述单体，还能够在＜所述pka值的ph下结合核酸，其中，优选地，所述第二材料、优选所述第二聚合物或所述低聚物或所述单体的所述pka值＞6。

6、在一个实施方案中，所述荧光标记物选自a)尺寸在50nm至10μm、优选100nm至5μm、更优选1μm至5μm、并且甚至更优选1μm至3μm范围内的荧光颗粒；b)附接至所述第一材料和/或第二材料、优选附接至所述第一聚合物和/或第二聚合物/所述低聚物/所述单体的非颗粒荧光染料；以及c)a)和b)的组合。

7、在一个实施方案中，所述磁性颗粒的尺寸在50nm至10μm、优选100nm至5μm、更优选1μm至5μm、并且甚至更优选1μm至3μm的范围内。

8、在一个实施方案中，所述第一材料、优选所述第一聚合物，包含结合构件，所述结合构件允许一个或多个扩增引物可逆且不依赖于ph地固定到所述第一材料、优选固定到所述第一聚合物，其中，优选地，对于这样的可逆且不依赖于ph的固定，所述结合构件特异性地与附接至所述一个或多个扩增引物的结合实体相互作用；其中，更优选地，所述微球还包含一个或多个扩增引物，其具有结合实体，所述结合实体通过所述第一材料、优选所述第一聚合物上的结合构件与在所述一个或多个扩增引物上的所述结合实体之间的所述特异性相互作用附接并固定到所述第一材料、优选第一聚合物；其中，甚至更优选地，所述结合构件选自亲和素、链霉亲和素及其衍生物，并且所述结合实体选自硫生物素、亚氨基生物素、具有可切割间隔臂的生物素、硒生物素、氧代生物素、高生物素、降生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物素砜、表生物素、5-羟基生物素、2-硫生物素、氮杂生物素、碳生物素、生物素的甲基化衍生物和酮生物素；反之亦然。应当注意，选择结合构件和结合实体，使得它们以可逆方式彼此相互作用，即彼此结合。

9、在一个实施方案中，所述第一材料是第一聚合物，并且选自琼脂糖、明胶、透明质酸、弹性蛋白、弹性蛋白样多肽、具有上限临界溶解温度(ucst)的热响应聚合物，例如选自聚(n-丙烯酰基甘氨酰胺)(pnaga)、聚(烯丙基胺)-共-聚(烯丙基脲)及其衍生物、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(n-丙烯酰基天冬酰胺)、聚(n-甲基丙烯酰基谷氨酰胺)、聚(丙烯酰胺)-共-(丙烯腈)、聚(磺基甜菜碱)、聚(磷酰胆碱)；以及在暴露于或包含水性溶液时能够形成多孔水凝胶，并且具有在40℃至90℃范围内的熔融温度的其他聚合物；并且所述第二材料是选自壳聚糖及其衍生物、明胶及其衍生物、甲基纤维素、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(乙烯亚胺)、聚(2-二甲基(氨基乙基)甲基丙烯酸酯)、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)和具有作为此类主链的一部分附接或并入的碱性氨基酸的聚合物主链的第二聚合物；或者所述第二材料是低聚物，优选选自寡肽，所述寡肽包含碱性氨基酸如组氨酸、赖氨酸和精氨酸或由其组成；或者所述第二材料是选自碱性氨基酸如组氨酸、赖氨酸和精氨酸的单体；

10、条件是当所述第一材料和所述第二材料分别是第一聚合物和第二聚合物时，所述聚合物是不同的；

11、其中，优选地，所述第一材料是未交联的第一聚合物，并且所述第二材料是交联的第二聚合物；或者，同样优选地，所述第一材料是第一聚合物，并且所述第二材料是与所述第一聚合物交联的第二聚合物；其中，更优选地，所述第一聚合物是琼脂糖，并且所述第二聚合物是交联壳聚糖。

12、在一个实施方案中，微球还包含水性溶液，使得所述第一材料、优选所述第一聚合物呈多孔水凝胶的形式。

13、在一个实施方案中，微球还包含核酸，所述核酸不是寡核苷酸引物，并且

14、-若所述水性溶液的ph＜所述第二材料、优选所述第二聚合物的所述pka值，则所述核酸结合到所述第二材料、优选所述第二聚合物，并且

15、-若所述水性溶液的ph≥所述第二材料，优选所述第二聚合物的所述pka值，则所述核酸仍通过所述第一材料、优选所述第一聚合物的所述多孔水凝胶保留在所述微球内或保留在所述第一材料、优选所述第一聚合物的所述多孔水凝胶中，但不必结合或不再结合到所述第二材料、优选所述第二聚合物。

16、不是寡核苷酸引物并且可结合到第二材料或由微球保留而不结合到第二材料的此类核酸的实例是来自样品的核酸，此类核酸是微生物或病毒的核酸，或者更一般地，其存在是旨在被测试或检测的靶核酸。

17、在一个实施方案中，所述水性溶液是：

18、a)用于洗涤和/或促进核酸与所述第二材料、例如所述第二聚合物结合的第一组合物，所述第一组合物具有＜所述第二材料、例如所述第二聚合物的所述pka值的ph值，或更优选地，所述第一组合物包含在＜所述第二材料、例如所述第二聚合物的pka值的ph范围内缓冲的缓冲液；或

19、b)用于促进和进行核酸扩增的第二组合物，所述第二组合物包含：在适合于进行核酸扩增的ph范围内缓冲的缓冲液、单核苷三磷酸、扩增酶，如合适的核酸聚合酶，例如taq聚合酶、任选的一个或多个扩增引物或一对或多对扩增引物，若其尚未固定到所述第一材料、优选固定到所述第一聚合物；以及任选的核酸染料，其用于检测扩增产物，例如扩增的核酸；和/或，任选地，包含相应的分子探针，例如taqman探针或分子信标；其中所述适合于进行核酸扩增的ph范围＞所述第二材料、例如所述第二聚合物的所述pka值。

20、在一个实施方案中，所述第二材料、选所述第二聚合物是非沉淀形式。当相应的微球未暴露于≥所述第二材料的pka值的ph值时尤其如此。

21、在一个实施方案中，所述多孔水凝胶内的网络未收缩。当相应的微球未经历其将被加热到温度＞第一材料、优选第一聚合物的熔化温度的热处理时尤其如此。

22、在又一个实施方案中，所述第二材料、优选所述第二聚合物是非沉淀形式，并且所述微球的所述多孔水凝胶内的网络未收缩。当相应的微球尚未暴露于≥所述第二材料的pka值的ph值时，并且当相应的微球未经历其将被加热到温度＞第一材料、优选第一聚合物的熔融温度的热处理时尤其如此。

23、在另一个实施方案中，所述第二材料、优选所述第二聚合物是沉淀形式。当相应的微球已经暴露于≥所述第二材料的pka值的ph值时尤其如此。

24、在一个实施方案中，所述多孔水凝胶内的网络已收缩。当相应的微球已经经历其将被加热到温度＞第一材料、优选第一聚合物的熔融温度的热处理时尤其如此。

25、在又一个实施方案中，所述第二材料、优选所述第二聚合物是沉淀形式，并且所述微球的所述多孔水凝胶内的网络收缩。当相应的微球已经暴露于≥所述第二材料的pka值的ph值时，并且当相应的微球已经经历其将被加热到温度＞第一材料、优选第一聚合物的熔融温度的热处理时尤其如此。

26、另一方面，本发明涉及一种与水和水性溶液不混溶的液相，例如油相，所述液相包含多个微球，其中第二材料、优选第二聚合物是非沉淀形式和/或其中所述水凝胶内的网络未收缩。

27、另一方面，本发明涉及一种与水和水性溶液不混溶的液相、例如油相，所述液相包含多个微球，其中第二材料，优选第二聚合物，为沉淀形式和/或其中所述水凝胶内的网络已收缩。

28、另一方面，本发明涉及从样品中捕获和/或富集一种或多种核酸的方法，所述方法包括：

29、a)在第一组合物中提供多个如权利要求1-8中任一项所定义的微球，(即尚未包含待捕获、富集、扩增和/或检测的一种(或多种)核酸的多个微球)，用于促进核酸与所述第二材料、优选所述第二聚合物的结合，或将所述多个微球暴露于所述第一组合物；所述第一组合物具有＜所述第二材料、例如所述第二聚合物的所述pka值的的ph值，或优选地，所述第一组合物包含在＜所述第二材料、例如所述第二聚合物的pka值的ph范围内缓冲的缓冲液；从而允许所述多个微球与所述第一组合物平衡并结合；其中优选地，所述第二材料、例如所述第二聚合物的所述pka值＞6；并且

30、b)将来自步骤a)的所述多个微球暴露于含有或疑似含有核酸的样品，从而允许所述核酸，如果存在，结合到所述第二材料、例如所述第二聚合物，优选地，所述样品还包含在＜所述第二材料、例如所述第二聚合物的pka值的ph范围内缓冲的缓冲液，从而捕获核酸，如果存在于所述样品中；

31、或者

32、a’)将多个如权利要求1-8中任一项所定义的微球暴露于含有或疑似含有核酸的样品，从而允许所述核酸，如果存在，结合到所述第二材料、例如所述第二聚合物，所述样品具有＜所述第二材料、例如所述第二聚合物的pka值的ph，其中优选地，所述样品包含在＜所述第二材料、例如所述第二聚合物的pka值的ph范围内缓冲的缓冲液；由此通过这样暴露捕获核酸，如果存在于所述样品中。

33、另一方面，本发明涉及一种从样品中扩增核酸的方法，所述方法包括进行如本发明所定义的用于捕获和/或富集核酸的方法；以及进行以下步骤：

34、(选项a)：

35、c)将来自步骤b)或步骤a’)的所述多个微球暴露于用于促进和进行核酸扩增的第二组合物，所述第二组合物包含在适合于进行核酸扩增的ph范围内缓冲的第二缓冲液、单核苷-三磷酸、扩增酶，如合适的核酸聚合酶，例如taq聚合酶，并且如果所述微球尚未包含通过所述第一材料、优选所述第一聚合物上的结合构件与一个或多个扩增引物上的结合实体之间的特异性相互作用而固定至所述第一材料、优选所述第一聚合物的所述一个或多个扩增引物，所述第二组合物还包含一个或多个扩增引物或一对或多对扩增引物；从而允许所述多个微球与所述用于促进和进行核酸扩增的第二组合物平衡并结合；任选地，所述第二组合物还包含用于检测扩增产物，如扩增的核酸的核酸染料，和/或，相应的分子探针，例如taqman探针或分子信标；其中优选地，适合于进行核酸扩增的所述ph范围＞所述第二材料、例如所述第二聚合物的所述pka值；

36、d)将步骤c)的所述多个微球置于用于促进和进行核酸扩增的所述组合物内的扩增方案中，该方案涉及或在其之前或之后有至少一个步骤，在该步骤中将所述悬浮液加热至＞所述第一材料、优选所述第一聚合物的熔融温度的温度，优选地，该方案涉及将所述多个微球的所述悬浮液暴露的温度重复且循环地增加和降低到允许扩增核酸的水平，如果所述核酸存在于所述微球中，所述核酸与所述一个或多个扩增引物或一对或多对扩增引物的序列相匹配；

37、或者(选项b)：

38、e)将来自步骤b)或步骤a’)的所述多个微球暴露于用于促进和进行核酸扩增的第二组合物，所述第二组合物包含在适合于进行核酸扩增的ph范围内缓冲的第二缓冲液、单核苷-三磷酸、扩增酶，如合适的核酸聚合酶，例如taq聚合酶，并且如果所述微球尚未包含通过所述第一材料、优选所述第一聚合物上的结合构件与一个或多个扩增引物上的结合实体之间的特异性相互作用而固定至所述第一材料、优选所述第一聚合物的所述一个或多个扩增引物，所述第二组合物还包含一个或多个扩增引物或一对或多对扩增引物；从而允许所述多个微球与所述用于促进和进行核酸扩增的第二组合物平衡并结合；任选地，所述第二组合物还包含用于检测扩增产物，如扩增的核酸的核酸染料，和/或，相应的分子探针，例如taqman探针或分子信标；其中优选地，适合于进行核酸扩增的所述ph范围＞所述第二材料、例如所述第二聚合物的所述pka值；

39、f)将来自步骤e)的所述多个微球转移到与水和水性溶液不混溶的液相，例如油相，从而生成所述多个微球通过所述液态的水不混溶相，例如油相而彼此分离的悬浮液；并且

40、g)将步骤f)的所述多个微球置于扩增方案中，该方案涉及或在其之前或之后有至少一个步骤，在该步骤中将所述悬浮液加热至＞所述第一材料、优选所述第一聚合物的熔融温度的温度，优选地，该方案涉及将所述多个微球的所述悬浮液暴露的温度重复且循环地增加和降低至允许扩增核酸的水平，如果所述核酸存在于所述微球中，所述核酸与所述一个或多个扩增引物或一对或多对扩增引物的序列相匹配，其中，由于加热至＞所述第一材料、优选所述第一聚合物的熔融温度的温度，所述微球中的所述第二材料、优选所述第二聚合物收缩，从而在各微球内产生收缩核心，其中荧光标记物和/或磁性颗粒，如果存在于或包含于相应微球中，在所述收缩核心内积聚，从而促进相应微球的检测和/或进一步操作，其中，优选地，使用在所述微球的所述收缩核心内积聚的i)所述荧光标记物和/或ii)所述磁性颗粒来定位和/或识别单个微球或多个微球。

41、在上述步骤方案中，选项a表示从样品中扩增核酸的方法的实施方案，其中微球不一定彼此分离，并且主要用于捕获和富集核酸。扩增在围绕(多个)微球的总体积(bulkvolume)中进行。

42、选项b表示从样品扩增核酸的方法的实施方案，其中微球必须彼此分离，并且每个微球用作可发生单独扩增反应的分离的反应空间/体积。该实施方案特别适用于以数字或均质形式进行核酸扩增。

43、在用于从样品扩增核酸的方法的一个实施方案中，该方法还包括如下步骤：

44、h)在用于促进和进行核酸扩增的所述组合物中(选项a)，或者在所述微球中(选项b)，检测扩增的核酸，如果存在；

45、其中所述扩增方案导致光学可检测信号的生成，所述光学可检测信号被生成在用于促进和进行核酸扩增的所述组合物中(选项a)，或者在围绕相应微球的所述收缩核心的空间中(选项b)；

46、并且其中所述光学可检测信号的检测指示扩增的核酸的存在。

47、在一个实施方案中，使用在所述微球的所述收缩核心内积聚的i)所述荧光标记物和/或ii)所述磁性颗粒来定位和/或识别单个微球或多个微球。

48、在一个实施方案中，使用在所述微球的所述收缩核心内积聚的i)所述荧光标记物和/或ii)所述磁性颗粒；和/或iii)在融合微球内存在多于一个收缩核心；和/或iv)在非融合微球内仅存在一个收缩核心，将融合微球与非融合微球区分开。

49、另一方面，本发明涉及多个如本文所定义的微球在检测多种核酸分析物的测定中的用途，所述用途包括：进行根据如本文所定义的本发明的从样品扩增核酸的方法，并且其中所述用途涉及不同的多个微球，每一多个微球包含不同的荧光标记物，并且由于包含用于扩增特定核酸分析物的特异性扩增引物或特定的一对这样的扩增引物而对所述特定核酸分析物具有特异性，其中所述不同的多个微球能够通过所述荧光标记物可检测地彼此区分，并且其中每一多个微球对不同的核酸分析物具有特异性。

50、另一方面，本发明涉及多个如本发明中所定义的微球在检测多个样品中的单个核酸分析物的测定中的用途，所述用途包括：进行根据如本文所定义的从本发明的样品中扩增核酸的方法，并且其中所述用途涉及不同的多个微球，每一多个微球包含不同的荧光标记物并且还包含用于扩增所述单个核酸分析物的扩增引物或一对这样的扩增引物，每一多个微球通过在步骤b)或a’)中单独暴露于特定样品而对这样的特定样品具有特异性，其中所述不同的多个微球能够通过所述荧光标记物可检测地彼此区分，并且其中每一多个微球对相同的核酸分析物具有特异性，并且对不同的样品具有特异性。

51、本发明人已经设计了一种新型微球，其特别适合于核酸捕获和/或扩增方案，并且可以容易且单独地识别和处理。根据本发明的实施方案的微球允许通过相应的微球从样品有效结合/捕获核酸，并允许随后在微球内浓缩/富集核酸。根据本发明的实施方案的微球显示了热响应特性，其例如在需要识别和/或定位和/或检测单个微球的方案中特别有益。不希望受任何理论的束缚，本发明人相信浓度/富集提供了任何靶核酸对珠粒内提供的扩增/检测试剂的改善的接近/可及性。同样地，因为根据本发明的微球还包含a)荧光标记物和b)磁性颗粒中的至少一种，所以任何这样的荧光标记物和/或磁性颗粒将集中在小体积内，即在微球的内部集中在小的集中体积(本文中有时也称为“核心”)内，其包含沉淀形式的第二交联材料，其可以是(第二)聚合物。因此，微球提供的剩余体积完全可用于检测/扩增反应，而荧光标记物和/或磁性颗粒集中在小体积内并且不干扰任何此类检测/扩增反应。此外，因为存在于微球内的任何荧光标记物和/或磁性颗粒从由微球限定的反应体积的外部区域移除，所以可以在用于微球的特异性标记的相同荧光通道中读取目标特异性信号(即，用于确定和指定单个微球的代码)。这是因为任何靶特异性信号(即来自扩增的核酸靶的信号)将位于由微球限定的反应体积的此类外部区域中，这意味着微球的荧光标记物信号(＝代码)在物理上和空间上与任何靶特异性信号分离，因此允许这两个信号之间的区分。

52、根据本发明的实施方案的微球是“混合(hybrid)”微球，其含义是它们包含第一材料、优选第一聚合物以及第二材料、优选第二聚合物，其中第一材料、优选第一聚合物是非交联的，并且第二材料、优选第二聚合物是交联的。如本文中所使用的，当第二材料、例如第二聚合物)被称为是交联的时，这意味着这样的第二材料、例如第二聚合物与其自身交联，或者与所述第一材料、例如所述第一聚合物交联。

53、在下文中，关于涉及作为“第一材料”的第一聚合物和作为“第二材料”的第二聚合物的示例性实施例进行各种陈述。然而，这样的陈述同样适用于第二材料是附接至所述第一材料、例如所述第一聚合物的低聚物或单体的实施例。

54、如本文所用，术语“附接”通常是指一个实体与另一个实体的连接，涉及这些实体之间的至少一个共价键。

55、在优选的实施方案中，术语“交联”是指第二材料、例如第二聚合物的“交联”性质，其含义是在存在一个或多个共价键将第二聚合物与其自身或第一材料、例如第一聚合物接合或连接在一起时其是“交联的”。例如，换言之，这种“化学交联”是指所述第二聚合物分子(类型)的两个或更多个分子通过一个或多个共价键的分子间接合，或者是指所述第二聚合物(类型)的单个分子通过一个或多个共价键与其自身的分子内接合，即，所述第二聚合物(类型)的此类分子的链的不同延伸部分(stretch)通过一个或多个共价键彼此连接，或者是指所述第二聚合物(类型)的一个或多个分子通过一个或多个共价键与所述第一聚合物(类型)的一个或多个分子的分子间接合。

56、在第二材料是低聚物或单体的实施例中，这种低聚物或单体附接至所述第一聚合物。

57、当根据本发明的实施方案的微球用于其中微球包含在液态的水不混溶相，例如油相中的方案时，并且其中这样的方案涉及或在其之前或之后有至少一个步骤，在该步骤中微球被加热至＞第一聚合物的熔融温度的温度，所述第一聚合物经历从凝胶到可溶性状态的相变，并且由每个微球提供的反应隔室可以被认为是液滴。由于液滴有时会发生融合(fuse)，这表示在处理、操作和/或加工中带来了潜在问题，因为不同的微球，即液滴，可能对不同的目标分析物具有特异性，因此，不同的捕获/扩增反应可能由于这种融合而混合。然而，因为根据本发明实施方案的微球包含交联的第二聚合物(或附接至所述第一聚合物的低聚物或单体)，并且由于微球暴露于＞第一聚合物的熔融温度的温度而形成收缩网络，所以第二聚合物的这种网络变成可以在微球的体积内容易识别的紧凑结构(类似于鸡蛋中的蛋黄)。这种由收缩网络形成的紧凑结构在本文中有时也称为微球的“核心”。此外，所述第二聚合物的收缩网络(“核心”)也集中了存在于微球内的任何荧光标记物和/或磁性颗粒，因此这种收缩网络提供了识别和/或定位和/或检测单个微球的稳健手段。它还提供了控制微球融合和识别任何融合的微球的优异手段。这是因为此类融合微球将含有与形成此类融合的一部分的微球一样多的收缩网络。这些收缩的网络(＝“核心”)仍然可以在所谓的单个微球体积内单独区分，因此这种融合微球可以容易地与非融合微球区分。

58、如本文所用，术语“微球”是指球形体，或基本上球形或椭圆形或其他圆的形状，例如蛋形体，其包含如本文所定义的第一材料、优选第一聚合物以及第二材料、优选第二聚合物，其平均直径在20μm至500μm、优选20μm至200μm、更优选20μm至100μm的范围内。

59、根据本发明的实施方案，本发明人提供了一种微球(和多个这样的微球)，其包含第一材料、优选第一聚合物以及第二材料、优选第二聚合物，其中，优选地，所述第一聚合物是在暴露于或包含水性溶液时能够形成多孔水凝胶的非交联聚合物，其中所述第一聚合物具有在40℃至90℃的范围内的熔融温度；并且其中所述第二聚合物是具有pka值并且能够在ph≥所述pka值的水性环境中沉淀的交联聚合物；其中所述第二聚合物形成网络，其中所述网络在暴露于≥所述第一聚合物的所述熔融温度的温度时能够收缩；并且其中所述微球还包含a)荧光标记物和b)磁性颗粒中的至少一种。在优选的实施方案中，所述微球包含a)荧光标记物和b)磁性颗粒。

60、在优选的实施方案中，术语“交联”是指第二聚合物的“交联”性质，其含义是存在一个或多个共价键将第二聚合物与其自身或第一材料、例如第一聚合物接合或连接在一起。换言之，这种“化学交联”是指所述第二聚合物(类型)的两个或更多个分子通过一个或多个共价键的分子间接合，或者是指所述第二聚合物(类型)的单个分子通过一个或多个共价键与其自身的分子内接合，即，所述第二聚合物(类型)的此类分子的链的不同延伸部分通过一个或多个共价键彼此接合，或者是指所述第二聚合物(类型)的一个或多个分子通过一个或多个共价键与所述第一聚合物(类型)的一个或多个分子的分子间结合。

61、当本文提及第一聚合物优选是“非交联的”时，这意味着所述第一聚合物不与其自身交联。然而，这种非交联的第一聚合物可以是网络的一部分，其中所述第二聚合物在上述意义上交联。

62、根据本发明的实施方案，第二材料、优选第二聚合物，具有pka值并且能够在大于或等于其pka值的ph值的水性环境中沉淀。此外，优选地，因为所述第二聚合物是交联聚合物，所以它能够形成网络，并且当暴露于大于或等于所述第一聚合物的熔融温度的温度时，这种网络能够收缩。由于根据本发明的微球暴露于升高的温度，所述升高的温度大于或等于所述第一材料、例如第一聚合物的熔融温度，由第二材料、例如第二聚合物或由第二材料和第一材料一起形成的网络将收缩并将形成核心，即在微球的总体积内的限定体积，所述限定体积与所述微球的总体积相比是更小的体积。不希望受任何理论的束缚，本发明人相信，在所形成的网络中，所述第二材料、例如第二聚合物的延伸部分和区域与所述第一材料、例如第一聚合物的延伸部分和区域缠绕在一起，并且在网络收缩时，将拉入并将所述第一材料、例如第一聚合物的这种缠绕区域和延伸部分也集中在收缩网络内。因此，这种收缩网络将在微球内形成致密的集中核心。

63、根据本发明的实施方案，当第一材料是第一聚合物时，优选地，所述第一聚合物是非交联的聚合物，这意味着它不与其自身交联，即它是非交联的，其含义是其不具有将第一聚合物与其自身在分子间或分子内接合或连接在一起的一个或多个共价键。然而，如果在这样的实施例中，第二材料也是聚合物、即第二聚合物，其与所述第一聚合物交联，则这可能意味着第一聚合物也由于连接至所述第二聚合物而有效地“交联”。然而，在任何情况下，当在第一聚合物的上下文中使用时，术语“非交联”旨在表示所述第一聚合物不交联或不与其自身交联的情况。

64、优选地，第一聚合物是琼脂糖。优选地，第二聚合物是壳聚糖。如本文所用，术语“琼脂糖”意指还包括琼脂糖的衍生物，只要此类衍生物是非交联的(在前述意义上)，在暴露于或包含水性溶液时能够形成多孔水凝胶，并且具有40℃至90℃的熔融温度。如本文所用，术语“壳聚糖”意指由随机分布的β-(1→4)-连接的d-葡糖胺(脱乙酰化单元)和n-乙酰基-d-葡糖胺(乙酰化单元)组成的线性多糖。当这种“壳聚糖”是根据本发明实施方案的第二聚合物时，其能够在ph≥其pka值的水性环境中沉淀，并且其优选是交联的，如上所定义。术语“壳聚糖”还意指包括其酸加合物和/或酸式盐，例如壳聚糖hcl、壳聚糖谷氨酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖乙酸盐以及其羧甲基化形式，例如n-羧甲基壳聚糖。

65、因为根据本发明的实施方案的微球还包含a)荧光标记物和b)磁性颗粒中的至少一种，并且优选包含a)荧光标记物和b)磁性颗粒两者，因此在由第二聚合物或由第二聚合物与第一聚合物一起形成的网络收缩时，此类荧光标记物和/或此类磁性颗粒也将变得集中在所述收缩的网络(核心)内。不希望受任何理论的束缚，本发明人认为收缩网络具有如此小的平均孔径，以至于由于它们的较大尺寸，它将“拉入”荧光标记物和/或磁性颗粒。而且，不希望受任何理论的束缚，因此认为这种收缩具有多种效果：首先，这种收缩在微球的其余部分内提供了可用的体积，该体积是发生任何扩增和/或反应和/或检测的位置。其次，这种收缩提供了收缩网络内任何荧光标记物和/或磁性颗粒的浓度，从而有助于检测(→通过所述荧光标记物)或机械处理(→通过所述磁性颗粒)所述微球。

66、如本文所用，术语“荧光标记物”意指具有尺寸在50nm至10μm、优选100nm至5μm、更优选1μm至5μm、甚至更优选1μm至3μm的范围内的荧光颗粒；并且指附接至所述第一材料和/或所述第二材料、优选附接至所述第一聚合物和/或所述第二聚合物、更优选固定至所述第二聚合物的非颗粒荧光染料。在任一种情况下，即无论荧光标记物是颗粒或非颗粒，通过将微球暴露于≥所述第一材料、优选所述第一聚合物的所述熔融温度的温度而引起的所述网络的收缩将导致所述荧光标记物和/或所述磁性颗粒在核心(即由所述第二聚合物单独或与所述第一聚合物组合形成的收缩网络)内的集中。因此，在涉及荧光颗粒的优选实施方案中，此类荧光颗粒的尺寸大于收缩网络的平均网格或孔径。

67、如本文所用，术语“磁性颗粒”意指显示磁性行为从而允许此类颗粒被磁体吸引的颗粒。在一个实施方案中，所述磁性颗粒是铁磁颗粒。在另一个实施方案中，所述磁性颗粒是顺磁性颗粒。在另一个实施方案中，所述磁性颗粒是亚铁磁性颗粒。在又一个实施方案中，所述磁性颗粒是超顺磁性颗粒。在优选实施方案中，所述磁性颗粒是铁磁性或顺磁性颗粒。如本文所用，术语“磁性颗粒”旨在排除抗磁性颗粒。如本文所用，“磁性颗粒”优选地具有在50nm至10μm、优选100nm至5μm、更优选1μm至5μm、甚至更优选1μm至3μm范围内的尺寸和平均直径或在一个维度上的平均长度延伸。优选地，磁性颗粒尺寸和平均直径或在一个维度上的平均长度延伸是使得其大于收缩网络的平均网格或孔径，并且使得通过将微球暴露于≥所述第一材料、优选地所述第一聚合物的所述熔融温度的温度而引起的所述网络的收缩将导致所述磁性颗粒集中在在核心内，即由所述第二聚合物单独或与所述第一聚合物组合形成的收缩网络。

68、由上可知，所述收缩网络的平均孔径＜50nm，优选＜25nm，更优选＜15nm，甚至更优选＜10nm。

69、如本文所用，短语“所述微球包含a)荧光标记物和b)磁性颗粒中的至少一种”还意指设想或包括其中此类微球包含多于一种(类型的)荧光标记物和/或多于一种(类型的)磁性颗粒的情况。在根据本发明的微粒的一个实施方案中，所述微粒包含至少两种不同的荧光标记物。

70、根据本发明的实施方案的微球在本文中有时也同义地称为“珠粒”或“纳米反应器珠粒”。不希望受任何理论的束缚，根据本发明的实施方案的微球具有以下能力：a)经历从凝胶状态到可溶性状态的相变，因为第一聚合物是非交联的并且具有在40℃至90℃范围内的熔融温度；和b)进行内部重排，使得第二聚合物和由其形成的网络在暴露于大于或等于第一聚合物的熔融温度的温度时能够收缩，从而导致微球内部分隔，其中收缩的网络在由微球本身提供的较大(且密度较低)体积内形成致密区域或体积或“核心”。呈此类“核心”形式的此类内部分隔是可见的并且可被检测，并且此类检测通过所述核心内的荧光标记物和/或磁性颗粒的富集和/或浓度来促进。同时，尤其是在本发明的实施例中，其中微球位于液态的水不混溶相中，即，其中微球通过这样的水不混溶相与其它微球分离，这样的上述内部分隔还产生围绕所述核心的空间，在该空间中可以发生扩增反应和随后的检测。根据本发明的实施方案的微球在本文中有时也同义地称为“纳米反应器珠粒”或“纳米反应器微球”，因为它们提供并限定了可以发生靶核酸的结合和/或扩增的反应体积，同时可以容易地处理和检测纳米反应器珠粒或微球。

71、因为纳米反应器珠粒或纳米反应器微球的这种反应体积在纳升量级，所以有时也简称为“纳米反应器”。例如，平均直径分别为500微米、100微米和20微米的微球的体积分别为65纳升、0.5纳升和0.004纳升。

72、在一个优选的实施方案中，所述一个或多个扩增引物，即所述一个或多个分析物特异性试剂可逆且不依赖于ph地固定到所述第一材料、优选所述第一聚合物。如本文在一个实体“可逆地固定”在另一个实体上的上下文中所使用的，“可逆地”或“可逆地固定”优选地意味着一种附接类型，其中在合适的条件下实体之间的附接可以“被解除”，但也允许实体在合适的条件下再次彼此附接。这种可逆固定的释放通常发生，并且可以以这样的方式实现，即，使实体保持不变，并且特别是它们的结构和结合能力不变，并且允许两个实体彼此反复附接(即结合)和释放。这种可逆附接的典型实例是两条互补核酸链在合适条件(例如杂交条件)下的杂交，如果所得的双链暴露于不同的条件组(例如温度升高)，则该杂交可以逆转，导致双链再次解链成单链。在冷却时，两条链可以再次退火，从而证明所涉及的附接的可逆性质。在上述意义上不“可逆”的附接的实例是野生型生物素和野生型链霉亲和素之间的结合，其是已知的最强的非共价结合事件之一，并且除非一个或两个实体在结构上被改变或可能甚至被破坏，例如通过变性，否则不能逆转。

73、根据本发明的实施方案，在相应的第一材料、例如第一聚合物上固定扩增引物的可逆性质有利于根据使用者的需要定制制造微粒，并且还能够使相应的微粒文库适应多种不同的方法。根据相应的护理点环境及其需要，可以容易地制造个性化和/或定制的文库。此外，分析物特异性试剂的可逆附接使得可以在可能需要这种分析物特异性试剂的情况下分离这种分析物特异性试剂，例如当这种分析物特异性试剂应当可用于(并且可自由扩散)后续反应时，例如在需要自由可用的(可自由扩散的)分析物特异性试剂的方法方案中。优选地，这种可逆固定通过第一材料、例如第一聚合物发生，所述第一材料具有允许第一材料上的扩增引物的可逆固定的结合构件。在一个优选的实施方案中，这种结合构件附接至第一材料、例如微球的第一聚合物。这种结合构件被设计并且旨在与结合实体结合，所述结合实体进而与所述扩增引物缀合。在该优选的实施方案中，因此一方面在附接至微球的第一材料上的结合构件和另一方面在其上偶联了所述扩增引物的结合实体之间存在相互作用。在该优选实施方案中，选择结合构件和结合实体，使得它们以可逆方式彼此相互作用，即结合。作为一个实例，附接至第一材料的构件可以是链霉亲和素或其衍生物，并且与扩增引物缀合的结合实体可以是生物素或生物素衍生物，例如脱硫双生物素，反之亦然(即试剂结合分子是生物素或生物素衍生物，例如脱硫双生物素，并且结合实体是链霉亲和素或其衍生物)，只要两个实体之间的相互作用是可逆的并且结合可以例如通过变化，例如温度升高再次反转即可。例如，核酸引物(或一对核酸引物，以及任选地，检测探针)可以容易地缀合到脱硫生物素，或者甚至可以以这种脱硫生物素化形式商业提供。另一方面，第一材料可以具有附接的结合构件，其可以是链霉亲和素。在环境条件下，终端用户选择一对对感兴趣的分析物具有特异性的脱硫生物素引物，并且将其可逆地附接/固定在附接有链霉亲和素的微球的第一材料上是非常简单和容易的。在环境条件下生物素衍生物和链霉亲和素之间的结合事件易于通过在合适的条件下简单地将包含具有链霉亲和素作为结合构件的第一材料的微球暴露于这种(脱硫)生物素衍生物标记的引物的溶液来实现。然后可以通过例如简单地升高温度来容易地反转固定。

74、根据本发明的微球显示热响应特性，并且由于两种不同聚合物的存在，因此属于“混合”微球。因此，它们有时也被称为“混合热响应”微球或珠粒。