一种维生素H中间体手性内酯的高效液相色谱检测方法与流程

本发明涉及一种维生素h中间体手性内酯的高效液相色谱检测方法。

背景技术：

1、维生素h属于水溶性b族维生素，是碳水化合物、脂肪和蛋白质中间代谢的重要辅酶之一，是维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素，也是禽畜正常生长所必需的物质。在生物技术中的应用也取得了显著发展，这包括在免疫分析、抗原和抗体分析鉴定以及病毒感染检测等方面的应用。维生素h因其简单的结构、低毒性以及高度的肿瘤特异性，在肿瘤靶向治疗中展现出极高的应用潜力。

2、维生素h的生产，主要采用了提取法、发酵法和化学合成法等多种方法。其中，提取法是基于天然维生素h广泛存在于动物肝脏、肾脏、胰腺和其他内脏器官中这一特性，通过从这些富含维生素h的物质中，利用氧化铝色谱法进行提纯，从而得到维生素h。这种方法充分利用了天然资源的优势，为维生素h的获取提供了一种有效途径。但由于使用该方法的成本较高，且产量并不理想，只适用于提供生物化学所需的试剂，并为学校教学及科研服务。随着科技的进步和需求的增长，对于维生素h生产技术的研究和创新仍在持续进行中，以期实现更高效、更环保的生产过程。近年来，不少科研工作者通过微生物发酵法制备维生素h的研究也有所进展。但因其发酵过程中不少步骤的产量较低且质量不稳定，总体效果并不能满足实验预期，因此还有待更深入的研究。所以就目前而言工业生产维生素h主要依赖化学合成法。

3、其中(3as,6ar)-1,3-二苄基四氢-1h-呋喃[3,4-d]咪唑-2,4-二酮(右内酯，式1)作为维生素h合成中的关键中间体，为其提供了重要的核心手性骨架。而对于如式1所示的右内酯(式1，目标产物)及如式2所示的左内酯(式2，副产物)来说，两者互为镜面构象，依靠液相、核磁等常规技术手段难以直接实现分离并确定比例，且需要花费较大的时间精力。

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5、目前工业化生产上对手性内酯纯度的检测技术手段主要是对右内酯及其对映体左内酯的混合物进行旋光度的测定，标准右旋内酯的比旋光度[α]d25＝+60.0°，因此在实际生产中，右旋内酯(式1)占对映异构体的百分数可以根据公式：x％＝100*([α]d25-[α]d25左)/([α]d25右-[α]d25左)来计算。其中：[α]d25右＝+60°；[α]d25左＝-60°；所以x％＝100*([α]d25+60)/120。

6、通过人工测定旋光度值，代入上述公式中通过计算，最终得到右旋内酯产物的纯度。显然，该种测量方法操作比较繁琐，且人工测量更易造成误差。在旋光度测定的过程中，能对其产生干扰的因素有很多，例如待测样品的浓度、其它光学物质的干扰、光源的波长、旋光管的长度、温度等，都会对其结果造成影响，而右内酯(式1)的光学纯度对后续维生素h的生产起着至关重要的作用，前者造成的误差极有可能影响后续维生素h生产的工艺效果，对最终生成的维生素h的质量和产量都将产生影响。

7、手性衍生化试剂法(chiral derivatization reagent，cdr)是：被分析物先与高纯度的手性衍生试剂发生化学反应，生成非对映异构体结合物，然后在hplc色谱柱上进行分离检测的方法。

技术实现思路

1、鉴于现有技术存在的问题，本发明要解决的技术问题是提供一种维生素h中间体手性内酯的高效液相色谱检测方法，所述高效液相色谱检测方法包括如下步骤：

2、1)将如式1所示的右内酯和如式2所示的左内酯与手性胺衍化试剂在反应溶剂有机醇和一定温度下进行衍生法反应，得到酰胺衍生物；

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4、2)将步骤1)中得到的酰胺衍生物通过高效液相色谱进行分离检测。

5、根据本发明的技术方案，优选地，步骤1)中，所述手性胺衍化试剂为(1r,2r)-(-)-苏-1-(对硝基苯基)-2-胺基-1,3-丙二醇(式3，简称右胺)。

6、

7、根据本发明的技术方案，优选地，步骤1)中，所述衍生法反应的反应温度为90℃-140℃。

8、根据本发明所述高效液相色谱检测方法的技术方案，优选地，步骤1)中，所述有机醇为c4-c8的一元醇。更优选地，所述有机醇为正丁醇。

9、根据本发明所述高效液相色谱检测方法的技术方案，优选地，步骤2)中，所述高效液相的流动相为ch3cn和h2o，ch3cn与h2o的体积比为20-50：80-50。更优选地，ch3cn与h2o的体积比为30：70。

10、根据本发明所述高效液相色谱检测方法的技术方案，优选地，步骤2)中，所述高效液相的色谱柱为c18液相色谱柱，优选为eclipse c18，4.6×250mm×5um。

11、根据本发明所述高效液相色谱检测方法的技术方案，优选地，步骤2)中，所述高效液相的色谱柱的柱温为25-30℃。更优选地，所述高效液相的色谱柱的柱温为30℃。

12、根据本发明所述高效液相色谱检测方法的技术方案，优选地，步骤2)中，所述高效液相的流动相的流速为0.95-1.05ml/min。更优选地，所述高效液相的流动相的流速为1ml/min。

13、根据本发明所述高效液相色谱检测方法的技术方案，优选地，步骤2)中，进样量为10-20μl，检测波长254nm。更优选地，进样量为10μl，检测波长254nm。

14、本发明将生成的手性酰胺衍生物与高效液相色谱(hplc)技术结合，利用衍生物之间的极性和构型差异，以及不同的液相体系对两者进行区分并配合核磁进行结果验证。采用手性胺衍生化hplc法，以(1r,2r)-(-)-苏-1-(对硝基苯基)-2-胺基-1,3-丙二醇(式3，右胺)为手性衍生化试剂，色谱柱:c-18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相:乙腈:水(30∶70,v/v)；流速为1.0ml·min-1；检测波长为254nm；柱温为30℃；进样量为10μl。

15、实验结果显示：内酯对映体混合物通过衍生反应获得较好分离效果，左内酯和右内酯对映体的手性胺衍生物的色谱峰保留时间分别在2.9min和5.3min处。该方法简便、准确、快速，为内酯的光学纯度的测定提供了参考依据，同时为工业生产中解决手性内酯纯度的精确测定提供了可行思路。

技术特征：

1.一种维生素h中间体手性内酯的高效液相色谱检测方法，所述高效液相色谱检测方法包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其中，步骤1)中，所述手性胺衍化试剂为(1r,2r)-(-)-苏-1-(对硝基苯基)-2-胺基-1,3-丙二醇。

3.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其中，步骤1)中，所述衍生法反应的反应温度为90℃-140℃。

4.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其中，步骤1)中，所述有机醇为c4-c8的一元醇。

5.如权利要求4所述的高效液相色谱检测方法，其中，所述有机醇为正丁醇。

6.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其中，步骤2)中，所述高效液相的流动相为ch3cn和h2o，ch3cn与h2o的体积比为20-50：80-50。

7.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其中，步骤2)中，所述高效液相的色谱柱为c18液相色谱柱。

8.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其中，步骤2)中，所述高效液相的色谱柱的柱温为25-30℃。

9.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其中，步骤2)中，所述高效液相的流动相的流速为0.95-1.05ml/min。

10.如权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其中，步骤2)中，进样量为10-20μl，检测波长254nm。

技术总结本发明提供了一种维生素H中间体手性内酯的高效液相色谱检测方法，所述高效液相色谱检测方法包括如下步骤：1)将如式1所示的右内酯和如式2所示的左内酯与手性胺进行衍生法反应，得到不同手性酰胺衍生物；2)将不同手性酰胺衍生物通过高效液相色谱法进行分离检测。本发明的内酯对映体衍生物获得了较好的分离效果。技术研发人员：王红卫,沈润溥,黑延琳,郭冬初,蔡亮,陈鹏程,俞春晓,章良受保护的技术使用者：浙江医药股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/20