鱼胶原蛋白肽及其组合物及在制备改善皮肤的饮品上的应用的制作方法

本发明涉及鱼胶原蛋白，具体涉及第鱼皮的鱼胶原蛋白肽及其组合物及在制备改善皮肤的饮品上的应用。

背景技术：

1、皮肤中胶原蛋白含量高达70％，如果皮肤里胶原蛋白的含量减少，水分含量会逐渐流失，皮肤的含水量下降会导致皮肤失去柔软性，失去光泽，使皮肤变得粗糙，从而加速皮肤老化的发生。胶原蛋白分子含有甘氨酸等成分，能提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿。胶原蛋白对皮肤具有保水、保湿及保持弹性等重要作用。从第鱼中开发胶原蛋白或胶原蛋白肽以作为改善皮肤的原料还未见报道。为深度挖掘第鱼，利用其资源，故而提出本发明。

技术实现思路

1、本发明提供了鱼胶原蛋白肽及其组合物及在制备改善皮肤的饮品上的应用。

2、具体地，本发明提供了一种第鱼皮胶原蛋白肽的制备方法。该方法包括：对所述第鱼皮进行预处理；从经所述预处理的所述第鱼皮中提取酶溶性胶原蛋白；将所述酶溶性胶原蛋白进行酶解，得到酶解物；对所述酶解物进行超滤分离，收集分子量小于1kd的组分；对所述分子量小于1kd的组分进行sephadex g-15凝胶色谱分离，洗脱收集抗氧化活性最高的组分；对所述抗氧化活性最高的组分进行全自动高压制备分离纯化，收集洗脱组分；根据lc-ms/ms分析，从所述洗脱组分中分离及鉴定所述第鱼皮胶原蛋白肽。

3、具体地，对所述第鱼皮进行预处理的步骤包括：将晒干的第鱼皮按1:20(m/v)的料液比用0.1m的碱溶液搅拌鱼骨48h，中间换液4次，用来除去非胶原物质，蒸馏水洗至中性；接着将鱼骨浸泡于浓度为0.5m乙二胺四乙酸二钠盐溶液中搅拌48h进行脱钙处理，中途换液4次，处理完后清洗数遍；然后用15％的异丙醇溶液搅拌鱼骨直至除去鱼骨中的脂肪，然后将异丙醇清洗干净。

4、具体地，提取酶溶性胶原蛋白的步骤包括：将经所述预处理的所述第鱼皮按1:30(m/v)料液比加入含0.5wt％的胃蛋白酶的0.5m乙酸溶液中，于4℃搅拌，用脱脂棉纱布过滤；向滤液中加入氯化钠溶液进行盐析并不断搅拌至无沉淀洗出，将悬浊液在4℃、12000rpm的条件下离心，离心管底部的沉淀复溶于0.5m乙酸溶液，最后装入透析袋透析至中性，冷冻干燥，制得酶溶性胶原蛋白。

5、具体地，所述酶解的步骤包括：取于酶溶性胶原蛋白蒸馏水中均匀混入5000u/g菠萝蛋白酶，调节ph7.0和温度条件40℃，反应5h后，水浴煮沸10min灭活，4℃、12000rpm离心取上清液，冻干即得酶解物。

6、具体地，sephadex g-15凝胶色谱分离的步骤包括：将收集的小于1kd的组分用超纯水配置成100mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜过滤后，静态上样5ml后以流速0.2ml/min的超纯水洗脱，收集洗脱液(1ml/管)，280nm下检测吸光值，分别收集不同吸收峰溶液，冻干后测定其抗氧化活性。

7、具体地，所述全自动高压制备分离纯化的步骤包括：将r2组分的冻干粉配制成40mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜过滤后上样hp plus 10d高压制备纯化系统，以水和乙腈(含0.1％三氟乙酸)的混合液为流动相，乙腈相的洗脱梯度为10％～95％，进样量为5ml，流速为2ml/min，洗脱时间为90min，检测波长为280nm，收集洗脱峰，冷冻干燥。

8、具体地，lc-ms/ms分析的步骤包括：

9、质谱方法：正离子检测模式，一级分辨率为120000，agc设置为3e6，扫描范围为300～1400m/z；从单张mc谱中选取10格强度最高的离子进行ms/ms分析，二级分辨率为15000，agc设置为2e4，分离窗口为1.6m/z；

10、液相方法：色谱柱为eksigent c18(3μm，250mm×75μm)，a相为水+0.1％甲酸；b相为乙腈+0.1％甲酸；流速为300nl/min，进样体积为4μl，色谱梯度洗脱80min；洗脱条件为：0→16min，93％a→88％a；16→51min，88％a→70％a；51→71min，70％a→58％a；71→72min，58％a→5％a；72→80min，5％a；

11、数据处理方法：所得结果用peaks软件进行ncbi数据库检索；数据处理过程中，首先根据每张ms/ms谱图中的碎片的分子量信息计算出可能的氨基酸组合，然后再比对到样本来源的蛋白数据库中，样本采用ncbi中harpadon nehereus物种的蛋白数据库。

12、具体地，本发明还提供了所述的制备方法制得的鱼胶原蛋白肽及其组合物，所述鱼胶原蛋白肽的氨基酸序列为lshgfnk或lrgsflr。

13、具体地，本发明还提供了一种复合饮品的配制方法。所述复合饮品的配方包括：11.2g/l鱼胶原蛋白肽lshgfnk或lrgsflr中任一种、40g/l金桔汁、8g/l柠檬汁、64g/l橙汁、10g/l白砂糖、0.2g/l羧甲基纤维素钠、0.25g/l低分子透明质酸钠、0.04g/l对羟基苯甲酸乙酯。

14、所述配制方法包括：

15、水果的挑选、清洗及榨汁：选取色泽正常、香味浓郁、充分成熟、无霉烂、无病虫危害、无其他明显不良变化的金桔、柠檬、橙三种鲜果为加工原料，清洗金桔、柠檬、橙表面的灰尘、杂质、微生物及农药残留，剥皮将可食果肉部分压榨，将压榨好的果汁冷藏贮存；

16、溶糖：用80℃～85℃热水，高速搅拌10min，白砂糖完全溶解；

17、其他原料预处理：对羟基苯甲酸乙酯先用30℃～40℃温水稀释5～10倍，并用200目滤袋进行过滤；将羧甲基纤维素钠、低分子透明质酸钠与白砂糖干混，然后进行溶解制成溶液；

18、混合调配：除鱼胶原蛋白肽外，加料搅拌，各间隔5min，原料加完后继续搅拌至混合均匀，加水定容；然后通过双联过滤器进行过滤；

19、真空脱气：向滤液中加入鱼胶原蛋白肽，充分混合后，进行真空脱气，脱气的条件为：温度60℃，真空度0.08mpa；

20、高压均质：采用的均质压力为18mpa～20mpa。

21、具体地，本发明还提供了所述的鱼胶原蛋白肽及其组合物在制备改善皮肤的饮品中的应用。

22、本发明提供的制备方法，通过对第鱼皮进行预处理，从中提取酶溶性胶原蛋白，并对酶溶性胶原蛋白进行酶解，将酶解物进行超滤分离、凝聚色谱分离和全自动高压制备色谱分离纯化，通过lc-ms/ms分析筛选和比对，得到了两种鱼胶原蛋白肽lshgfnk和lrgsflr。

23、本发明将两种鱼胶原蛋白肽作为原料，复配金桔、柠檬、橙三种鲜果得到的复合饮品稳定性良好，色泽微黄色，无褐变，色泽均匀一致，组织状态：呈均匀的浑浊液，无悬浮物，无分层，长时间静置后允许稍有沉淀；滋味和气味：口味酸甜，有金桔、柠檬、橙的水果清香，无腥臭味和其他不良气味。

24、本发明通过细胞毒性实验发现，本发明提供的复合饮品以及测试溶液无细胞毒性。

25、本发明通过细胞实验发现，本发明提供的复合饮品以及测试溶液对uva刺激hacat细胞具有保护作用。

26、本发明体内模型实验发现，本发明提供的复合饮品以及测试溶液能够促进加快大鼠创面愈合，促进创面皮肤保持组织活力，抑制创面皮肤的il-1α炎症表达，并且还能促进皮肤模型屏障蛋白表达。也即，本发明提供的复合饮品以及测试溶液不仅具有愈合皮肤的功能，还具有抗炎及改善皮肤屏障方面的功效。