一种胶原蛋白的纯化方法与应用与流程

本发明涉及胶原蛋白制备领域，具体涉及一种胶原蛋白的纯化方法与应用。

背景技术：

1、胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物骨、脚、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的1/3，是人体重要的细胞外基质成份，由于胶原蛋白具有易于设计和修饰的基本单元氨基酸、没有细胞毒性、可调控的生物降解速度、能特异促进或抑制细胞与材料的相互作用、能引发的免疫反应和炎症小、生物化学相容性优良等优点广泛应用于化妆品或医疗器械中。

2、目前，市售的胶原蛋白大多提取自猪皮、牛皮、或鱼鳞等动物组织中，但动物胶原蛋白与人胶原蛋白属于非同源物质，两者基因序列上存在根本性的差异，故，动物胶原蛋白进入人体存在免疫阻隔，因此，越来越多的研究集中于重组人源类人胶原蛋白上，目前的研究表明，重组人源类人胶原蛋白的基因序列与人iii型胶原蛋白基因序列高度一致，组织相容性好，被人体免疫防线认为是自身物质，能顺利透过进入真皮层，而且iii型重组人源类人胶原蛋白不需分解异化过程，能直接被人体吸收同化利用，直接参与构建肌底胶原，利用度高，修复速度快，不仅适用于护肤美容产品，在损伤修复、组织再生、生命大健康等多个领域均有应用。但在分子间作用力的疏水键的作用下，iii型重组人源类人胶原蛋白的三螺旋结构会形成多聚物，使得分离难度大，胶原蛋白的纯度低。

3、现有技术公开了一种胶原蛋白纯化方法，通过对胶原蛋白粗提取液盐析后超滤得到纯化的胶原蛋白，但无法分离胶原蛋白中的多聚物，导致纯化后的胶原蛋白纯度低。

技术实现思路

1、因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的无法分离胶原蛋白中多聚体，导致胶原蛋白纯度低的缺陷，从而提供一种胶原蛋白的纯化方法，提高胶原蛋白的纯度。

2、一方面，本发明提供一种胶原蛋白的纯化方法，包括如下步骤，

3、s1，采用平衡液对阳离子交换层析柱进行平衡，所述阳离子交换层析柱的填料为单分散聚合物基质；

4、s2，将胶原蛋白粗品的电导率与ph值调节至与平衡液相同；

5、s3，将步骤s2中调节后的胶原蛋白粗品加载到所述阳离子交换层析柱上进行层析。

6、所述单分散聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯，丙烯酸酯，聚苯乙烯中的至少一种。

7、单分散聚合物的粒径为30-70μm。

8、单分散聚合物的孔径为100-300nm。

9、步骤s3中层析的洗脱程序包括采用第一混合液对层析柱进行一次洗脱后，采用第二混合液对层析柱进行二次洗脱。

10、所述胶原蛋白粗品加载到阳离子交换层析柱上的线性流速为120-180cm/h。

11、所述胶原蛋白粗品中蛋白浓度为8-12mg/ml。

12、所述一次洗脱和/或二次洗脱的洗脱线性流速为130-260cm/h。

13、所述第一混合液为流动相a和流动相b按照体积比2-3∶1-2混合而成；

14、所述第二混合液为流动相a和流动相b按照体积比81-121∶99混合而成。

15、所述平衡液的电导率为1.8-10ms/cm，ph值为3.5-5.5。

16、所述流动相a和/或平衡液为缓冲液。

17、所述流动相b为缓冲液和无机盐的混合液。所述无机盐为氯化钠、硫酸铵中的至少一种。所述流动相b中的无机盐的浓度为50-1000mm。

18、所述流动相a和/或流动相b的ph值为3-6。

19、所述缓冲液为醋酸-醋酸盐缓冲液，柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液，甘氨酸-盐酸缓冲液中的至少一种。所述缓冲液的浓度为10-100mm。

20、胶原蛋白粗品的电导率调节方法为向胶原蛋白粗品中加入电解质、稀释或浓缩。

21、胶原蛋白粗品的ph值调节方法为向胶原蛋白粗品中加入酸物质或碱物质。

22、另一方面，本发明提供上述胶原蛋白的纯化方法能够应用于制备重组iii型胶原蛋白。

23、本发明技术方案，具有如下优点：

24、1.本发明提供的胶原蛋白的纯化方法，包括，采用平衡液对阳离子交换层析柱进行平衡，所述阳离子交换层析柱的填料为单分散聚合物；将胶原蛋白粗品的电导率与ph值调节至与平衡液相同；将胶原蛋白粗品加载到所述阳离子交换层析柱上进行层析。由于胶原蛋白与杂质的等电点存在差异，本发明采用单分散聚合物作为阳离子交换层析柱的填料，同时将胶原蛋白粗品的电导率与ph值调节至与平衡液相同，利用单分散聚合物分辨率高的特点，依据胶原蛋白分子与杂质带电荷的差异，能够有效的分离胶原蛋白与杂质，特别是多聚体杂质，简化了胶原蛋白的纯化步骤。

25、2.本发明提供的胶原蛋白的纯化方法，采用聚甲基丙烯酸甲酯，丙烯酸酯，聚苯乙烯中的至少一种的单分散聚合物作为填料。本发明采用粒度均一的材料不会引起蛋白质的变性还能够将胶原蛋白与杂质分离，纯化的胶原蛋白纯度高。

26、3.本发明提供的胶原蛋白的纯化方法，其中，所述层析的洗脱程序包括采用第一混合液对层析柱进行一次洗脱后，采用第二混合液对层析柱进行二次洗脱。本发明采用第一混合液将吸附在层析柱上的杂质进行优先洗脱，在用第二混合液将吸附在层析柱上的胶原蛋白洗脱得到纯化的胶原蛋白，多聚体仍然与层析柱结合，未被洗脱而保留在层析柱上，因此，纯化的胶原蛋白纯度高。

27、4.本发明提供的胶原蛋白的纯化方法，包括，流动相b为缓冲液和无机盐的混合液，其中，无机盐的浓度为50-1000mm。本发明采用含有一定浓度的无机盐缓冲液对胶原蛋白进行洗脱，洗脱效率高，分离效果好。

技术特征：

1.一种胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤，

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述单分散聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯，丙烯酸酯，聚苯乙烯中的至少一种；和/或，

3.根据权利要求2所述的胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤s3中层析的洗脱程序包括采用第一混合液对层析柱进行一次洗脱后，采用第二混合液对层析柱进行二次洗脱；和/或，

4.根据权利要求3所述的胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述第一混合液为流动相a和流动相b按照体积比2-3∶1-2混合而成；和/或，

5.根据权利要求1-4任一项所述的胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述平衡液的电导率为1.8-10ms/cm，ph值为3.5-5.5。

6.根据权利要求5所述的胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述流动相a和/或平衡液为缓冲液；和/或，

7.根据权利要求6所述的胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液为醋酸-醋酸盐缓冲液，柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液，甘氨酸-盐酸缓冲液中的至少一种；和/或，

8.根据权利要求7所述的胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述流动相a和/或流动相b的ph值为3-6；和/或，

9.根据权利要求1-8任一项所述的胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，胶原蛋白粗品的电导率调节方法为向胶原蛋白粗品中加入电解质、稀释或浓缩；和/或，

10.一种权利要求1-9任一项所述的胶原蛋白的纯化方法在制备重组iii型胶原蛋白上的应用。

技术总结本发明涉及胶原蛋白制备领域，具体涉及一种胶原蛋白的纯化方法与应用。其中，一种胶原蛋白的纯化方法，包括如下步骤，S1，采用平衡液对阳离子交换层析柱进行平衡，所述阳离子交换层析柱的填料为单分散聚合物；S2，将胶原蛋白粗品的电导率与pH值调节至与平衡液相同；S3，将步骤S2中调节后的胶原蛋白粗品加载到所述阳离子交换层析柱上进行层析。本发明采用单分散聚合物作为阳离子交换层析柱的填料，利用单分散聚合物分辨率高的特点，依据胶原蛋白分子与杂质带电荷的差异，能够有效的分离胶原蛋白与杂质，特别是多聚体杂质，简化了胶原蛋白的纯化步骤。技术研发人员：刘岩,李延军,张晶晶,雷晓菊受保护的技术使用者：西安蓝晓科技新材料股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/27