一种褐藻酸结合模块B1及其编码基因与应用

本发明涉及一种新型褐藻酸结合模块b1及其编码基因与应用，属于生物技术和基因工程。

背景技术：

1、碳水化合物活性酶具有降解、修饰及生成糖苷键的功能，包括糖苷水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶和辅助活性酶。许多碳水化合物活性酶具有多个结构域，除了发挥催化功能的催化模块外，还包含功能各异的不具有催化活性的附属模块，如碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module，cbm)和big(bacteriaimmunoglobulin)结构域。

2、cbm是多糖降解酶中研究最多的非催化模块，根据氨基酸序列的相似性，cbm在碳水化合物活性酶数据库中被划分为101个家族。cbm能够与多糖底物如纤维素、木聚糖、几丁质和褐藻酸等多糖结合，从而辅助催化模块的降解。在已报道的cbm中，与纤维素、木聚糖和几丁质等多糖结合的cbm已经得到广泛研究，但能够与褐藻酸结合的cbm较少，仅有cbm13、-32和-96三个家族的cbm被证明对褐藻酸具有结合能力。

3、big结构域在ghs中广泛存在，其通常由7至9个β-折叠片形成的两个β片层组成，共包含big_1-big_13共13个类群。近年来，big结构域在多糖降解酶中的作用被报道，如κ-卡拉胶酶ppcgk氨基酸序列的c端包含一个的big_2结构域ppbig_2，该结构域能够维持全酶催化活性，参与κ-卡拉胶的结合，并且对底物具有破坏作用。木聚糖酶xyl-orf19氨基酸序列的n端包含一个big_2结构域，该结构域对于维持xyl-orf19的酶活力具有重要的作用，并且改变了全酶的酶学特性如最适反应温度、最适ph和动力学参数。截至目前，关于具有多糖结合能力的big结构域的研究有限，其中具有褐藻酸结合能力的big结构域尚未被报道。

4、随着分子生物学和酶工程等技术的不断发展，目前研究者试图获得各种多糖结合模块与碳水化合物活性酶融合蛋白，以此来改良酶学特性，如提高酶与底物亲和力、酶的稳定性和酶活力等。此外，能够特异性结合褐藻酸的多糖结合模块可以作为生物探针，用于研究褐藻细胞壁的结构及褐藻合成褐藻酸的过程。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种新型褐藻酸结合模块b1及其编码基因与应用。

2、本发明技术方案如下：

3、一种新型褐藻酸结合模块b1，氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、根据本发明优选的，所述新型褐藻酸结合模块b1来自海水杆菌2-a2(aquimarinasp.2-a2)，该菌株于2024年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：cctcc m 2024766。

5、上述新型褐藻酸结合模块b1的编码基因，核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、根据本发明优选的，所述新型褐藻酸结合模块b1的编码基因来自海水杆菌2-a2，该菌株于2024年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：cctcc m 2024766。

7、一种重组表达载体，该重组表达载体包含有上述新型褐藻酸结合模块b1的编码基因。

8、一种重组细胞，该重组细胞包含有上述新型褐藻酸结合模块b1的编码基因。

9、上述褐藻酸结合模块b1和/或褐藻酸结合模块b1的编码基因作为褐藻酸结合组件在构建融合酶中的应用。

10、根据本发明优选的，所述融合酶为褐藻酸结合模块b1与褐藻酸裂解酶融合表达获得。

11、上述褐藻酸结合模块b1和/或褐藻酸结合模块b1的编码基因作为生物探针在研究褐藻细胞壁结构中的应用。

12、上述褐藻酸结合模块b1和/或褐藻酸结合模块b1的编码基因作为生物探针在研究褐藻合成褐藻酸过程中的应用。

13、本发明的技术特点：

14、本发明首先测定了海水杆菌2-a2的全基因组，然后从碳水化合物活性酶celaly中发现了一个新型的褐藻酸结合模块b1，属于big_7类。编码b1模块的核苷酸序列共285bp，编码95个氨基酸残基。根据其基因序列设计引物并利用pcr技术从海水杆菌2-a2的基因组dna中克隆了b1模块的基因，构建了含基因b1的表达载体并在大肠杆菌中进行异源表达，获得了b1模块的重组表达菌株，培养重组表达菌株并分离纯化获得b1模块。对纯化的b1模块进行褐藻酸结合实验测定，结果表明b1模块能够特异性结合具有复杂空间结构的天然褐藻酸。晶体结构解析表明b1模块整体呈β-三明治结构，9个β-折叠形成了两个β片层。b1模块的结合特性，使其可以作为生物探针来研究褐藻细胞壁的结构及褐藻合成褐藻酸的过程。此外，b1模块能够作为褐藻酸裂解酶融合表达的新的材料，在酶工程中具广阔的应用前景。

15、有益效果：

16、本发明公开了一种新型褐藻酸结合模块b1，属于big_7类，容易异源表达，能够特异性结合具有复杂空间结构的天然褐藻酸，为融合酶提供了新的材料，可以将褐藻酸结合模块b1与褐藻酸裂解酶融合，以增强其底物结合能力，提高催化效率，获得性能更优越的褐藻酸裂解酶。此外，该褐藻酸结合模块b1还可以作为生物探针应用在研究褐藻细胞壁结构以及褐藻合成褐藻酸的过程中。同时，本发明提供了褐藻酸结合模块b1的晶体结构，为其理性设计提供了结构基础。

技术特征：

1.一种褐藻酸结合模块b1，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.如权利要求1所述的褐藻酸结合模块b1，其特征在于，所述褐藻酸结合模块b1来自海水杆菌2-a2(aquimarina sp.2-a2)，该菌株于2024年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：cctcc m 2024766。

3.权利要求1所述的褐藻酸结合模块b1的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq idno.2所示。

4.如权利要求3所述的褐藻酸结合模块b1的编码基因，其特征在于，所述褐藻酸结合模块b1的编码基因来自海水杆菌2-a2，该菌株于2024年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号：cctcc m 2024766。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含有上述新型褐藻酸结合模块b1的编码基因。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含有上述新型褐藻酸结合模块b1的编码基因。

7.权利要求1所述的褐藻酸结合模块b1和/或权利要求3所述的褐藻酸结合模块b1的编码基因作为褐藻酸结合组件在构建融合酶中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述融合酶为褐藻酸结合模块b1与褐藻酸裂解酶融合表达获得。

9.权利要求1所述的褐藻酸结合模块b1和/或权利要求3所述的褐藻酸结合模块b1的编码基因作为生物探针在研究褐藻细胞壁结构中的应用。

10.权利要求1所述的褐藻酸结合模块b1和/或权利要求3所述的褐藻酸结合模块b1的编码基因在研究褐藻合成褐藻酸过程中的应用。

技术总结本发明涉及一种褐藻酸结合模块B1及其编码基因与应用。所述褐藻酸结合模块B1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开了一种新型褐藻酸结合模块B1，属于Big_7类，容易异源表达，能够特异性结合具有复杂空间结构的天然褐藻酸，为融合酶提供了新的材料，可以将褐藻酸结合模块B1与褐藻酸裂解酶融合，以增强其底物结合能力，提高催化效率，获得性能更优越的裂解酶。此外，褐藻酸结合模块B1还可以作为生物探针应用在研究褐藻细胞壁结构以及褐藻合成褐藻酸的过程中。同时，本发明提供了褐藻酸结合模块B1的晶体结构，为其理性设计提供了结构基础。技术研发人员：张玉忠,孙晓慧,徐菲,宋晓妍,陈秀兰受保护的技术使用者：山东大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2