构建强度范围广泄露表达低的无机磷响应元件库的方法及其应用

本发明涉及基因工程，具体涉及到强度范围广、泄露表达低的无机磷响应元件库的构建方法和应用。

背景技术：

1、在合成生物学领域，响应关键代谢物、细胞密度、培养条件(光、温度、酸碱度、无机离子等)的生物传感器受到了深入研究，被广泛应用于工业生产、食品安全和环境监测等领域。无机磷是细胞生命活动所必需的无机离子，在细胞组成、代谢和信号转导中发挥了重要作用；当环境中的无机磷浓度降低到4μm以下时，细胞会通过phobr双组分系统来激活无机磷饥饿响应来增加磷的摄取和储存。作为一种生物传感器，无机磷饥饿响应具有独立于代谢途径、易于操控、完全自诱导的优势。然而，天然无机磷响应启动子受多种信号的复杂调控，同时存在泄露表达严重、转录强度有限以及转录强度范围窄的问题，无法作为标准化的合成生物学元件，因此限制了无机磷响应系统的应用效果和应用范围。同时，目前无机磷启动子的改造方式是随机突变，改造效率低下且未能提升启动子性能，无法提供强度范围广、强度精细且泄露表达低的启动子元件库。

2、本发明通过对结构最简单的无机磷启动子pphoa进行结构功能分析，改变上游元件的长度和与结合位点的距离，偶联rbs序列改造，理性设计了32个强度范围在4286-95740之间梯度分布且泄露表达较低的无机磷响应元件。将本发明的元件应用到高磷条件下藻毒素的降解中，在24小时内实现了87.1％的降解；在低磷条件下，24小时内实现了大肠杆菌细胞90.7％的裂解，确保了改造系统的生物安全性。

技术实现思路

1、本发明提供了一种强度范围广、泄露表达低的无机磷响应元件库的构建方法。

2、本发明构建的元件库，通过对结构最简单的无机磷启动子pphoa进行结构功能分析，改变上游元件的长度以及与结合位点的距离，偶联rbs序列改造，理性设计了32个强度范围在4286-95740之间梯度分布且泄露表达较低的无机磷响应元件。

3、本发明提供了一种上述强度范围广、泄露表达低的无机磷响应元件库的构建方法，包括步骤：

4、上游序列顺序删除：通过引物pcr技术将基因组中pphoa启动子上游的20bp序列依次删除分别得到了保留11bp、7bp、0bp的启动子，然后使用荧光蛋白mcherry作为报告基因在多功能微孔板检测器中检测荧光强度。

5、上游元件位置测试：通过引物pcr技术将来自rrnb的17bp的高强度上游元件分别引入到结合位点上游0bp、3bp、5bp、7bp的位置，然后使用荧光蛋白mcherry作为报告基因在多功能微孔板检测器中检测荧光强度。

6、rbs序列设计与表征：在设计网站denovo dna中设计6bp不同强度梯度的rbs序列，通过引物pcr技术替换到组成型启动子pcon的rbs位置,然后使用荧光蛋白mcherry作为报告基因在多功能微孔板检测器中检测荧光强度。

7、组合构建无机磷响应元件库：将上游元件研究中得到的梯度强度启动子与rbs表征得到的梯度序列进行组合，然后使用荧光蛋白mcherry作为报告基因在多功能微孔板检测器中检测荧光强度，表征响应元件的表达目标基因的能力。同时，在高无机磷浓度下测定组合元件的泄露表达情况，同样使用荧光蛋白mcherry作为报告基因在多功能微孔板检测器中检测荧光强度。

8、本发明提供的元件库，通过对结构简单的磷响应启动子pphoa进行结构功能分析，改变上游元件的长度以及与结合位点的距离，偶联rbs序列改造，最终理性设计了32个强度范围在4286-95740之间梯度分布且泄露表达较低的无机磷响应元件。

9、本发明还提供一种强度范围广、泄露表达低的无机磷响应元件库在降解蓝藻水华产生的藻毒素的应用。水华蓝藻在高磷条件下发生，同时产生藻毒素来污染水体。其中，响应元件库自身在低磷条件下实现细胞的自裂解，同时无机磷响应元件通过表达阻遏蛋白laci来偶联iptg诱导的plac启动子，实现了高磷条件下激活藻毒素降解基因的表达来降解藻毒素。

10、本发明提供的无机磷响应元件库被用于藻毒素的降解，其中，藻毒素降解模块在高磷条件下启动来降解藻毒素而在低磷条件下不启动，藻毒素降解率在24h内达到了87.1％；细胞自裂解模块在高磷条件下不启动而在低磷条件下启动来确保生物安全性，细胞裂解率在24内到达了90.7％。

11、本发明提供的无机磷响应元件库与随机突变设计的元件库相比，其优点在于(1)改造效率高，仅仅构建了32个改造元件就得到了强度范围丰富的元件库。(2)相较于随机突变将强度范围拓展为0.43-1.13倍，本发明理性设计的结果将强度范围拓展为天然元件的0.11-2.51倍.(3)随机突变改造的高强度元件表现出50.7％的高泄露表达，而本发明改造的高强度元件的泄露表达率极低、受到磷浓度的严格调控，在0.10％-0.49％之间。

12、本发明提供的磷浓度响应元件库实现了磷浓度响应的藻毒素降解，进一步可以自由的用于磷浓度响应的基因表达调控、生物传感以及医学检测等领域。

技术特征：

1.构建强度范围广泄露表达低的无机磷响应元件库的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.应用权利要求1所述方法所构建的无机磷响应元件库在降解蓝藻水华产生的藻毒素的应用。

技术总结构建强度范围广泄露表达低的无机磷响应元件库的方法及其应用涉及基因工程技术领域。本发明通过对结构最简单的无机磷启动子P<subgt;phoA</subgt;进行结构功能分析，改变上游元件的长度和与结合位点的距离，偶联RBS序列改造，理性设计了32个强度范围在4286‑95740之间梯度分布且泄露表达较低的无机磷响应元件。将本发明的元件应用到高磷条件下藻毒素的降解中，在24小时内实现了87.1％的降解；在低磷条件下，24小时内实现了大肠杆菌细胞90.7％的裂解，确保了改造系统的生物安全性。技术研发人员：申晓林,童贻刚,付欢欢,袁其朋,王佳,孙新晓受保护的技术使用者：北京化工大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2