检测OPN1LW与OPN1MW基因单倍体型的试剂在近视诊断试剂盒中的应用及产品

本发明属于基因工程，具体涉及检测opn1lw与opn1mw基因单倍体型的试剂在近视诊断试剂盒中的应用及产品。

背景技术：

1、近视是屈光不正的一种，表现为当眼在调节放松状态下，平行光线进入眼内，其聚焦在视网膜之前，导致视网膜上不能形成清晰像。近视的原因包括遗传因素、环境因素和不良用眼习惯等。准确配镜对近视患者至关重要，因为不合适的眼镜可能加重近视症状，甚至导致其它眼健康问题。准确配镜不仅可以改善视力，还可以预防视力进一步下降。而对近视状况及原因的分析，对有效配镜有着举足轻重的作用。

2、有研究确定近视基因之一myp1突变的患儿，其视网膜对比度信号异常增高，进一步的研究发现，位于该基因片段内的opn1lw(长波长视锥蛋白基因)/opn1mw(中波长视锥蛋白基因)突变与人群近视易感性相关。opn1lw和opn1mw的突变(特定一些snp突变组合简称为单倍体型)导致其前信使rna剪接过程中出现严重的3号外显子跳跃或错误剪接，表达这些单倍体型的锥形光感受器几乎不含光色素。8种opn1lw和opn1mw基因常见单体型(liava、livva、lvava、liavs、miava、mvvva、mvava和liaia)与色觉缺陷、高度近视等多种视力障碍相关，其中lvava、livva、liava三种单倍体型是与中国人群高度近视相关的主要类型。这些单倍体型为第3号外显子snp的组合，分别位于p.153、p.171、p.174、p.178和p.180，以对应的氨基酸缩写进行编码。这些与近视和高度近视相关的单倍体型可导致不同程度的3号外显子跳跃，从而影响视蛋白的正常表达。相反，同一视网膜中表达非跳跃单倍型的视锥细胞相对充满光色素。由光色素含量不同的相邻视锥细胞产生的异常对比信号会刺激轴向伸长，从而导致远视力模糊。

3、此外，研究也发现，部分具有近视控制效果的镜片，如dot(diffusion opticstechnology，点扩散近视控制技术)镜片，通过在相邻锥体之间创造较低的信号差异来降低视网膜对比度，在减缓儿童近视进展方面是有效且安全，这也进一步证实了opn1lw和opn1mw单倍体型与导致高度近视的视锥感光细胞缺陷直接相关。因此，对于近视和高度近视患者，尤其是早发性高度近视人群，有必要通过基因检测明确opn1lw和opn1mw基因单倍体型信息，及早进行配镜干预，控制眼轴增长，从而降低继发于高度近视的危及视力的眼部疾病风险。

4、opn1lw和opn1mw基因的遗传分析复杂，这些基因串联排列在x染色体上，其拷贝数高度变异，但只有排在前两个的基因表达。大多数男性有三个视蛋白基因，大多数女性有六个视蛋白基因。此外，opn1lw和opn1mw基因同源性非常高(核苷酸序列同源性～98％)，常规的高通量测序技术无法将其准确比对到参考基因组上，因此不能准确判读前两个基因的序列，进而无法判读其单倍体型，同时也无法了解基因的表达情况。因此，亟需开发一种准确检测opn1lw和opn1mw表达基因单倍体型的方法，用于指导配镜。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种基于巢氏pcr和sanger测序对opn1lw和opn1mw表达基因单倍体型进行检测，第一轮特异性扩增opn1基因簇的第一个基因(opn1lw或opn1mw基因)，第二轮进一步确定基因单倍体型及单倍体型来源。灵敏度、准确度高，操作简便，可一次性检测各种opn1基因单倍体型，并确定单倍体型的基因来源。

2、一方面，本发明提供了一种检测opn1lw和/或opn1mw基因单倍体型的试剂，所述的试剂包括第一轮扩增引物和第二轮扩增轮引物；所述的第一轮扩增引物的序列如seq idno.1-seq id no.2所示，扩增opn1lw和/或opn1mw基因簇的第一个基因；所述的第二轮扩增轮引物如seq id no.3-seq id no.6所示，扩增的底物为第一轮扩增的产物。

3、具体地，所述的试剂还包括扩增预混液；

4、具体地，所述的第一轮扩增引物的扩增体系为：

5、

6、

7、进一步具体地，所述的扩增预混液1包括但不限于：扩增缓冲液、mg2+或热启动酶中的一种或多种。

8、所述的第一轮扩增引物的扩增程序为：

9、

10、具体地，所述的第二轮扩增引物的扩增体系为：

11、

12、进一步具体地，所述的扩增预混液2包括但不限于：扩增缓冲液、mg2+或热启动酶中的一种或多种。

13、所述的第二轮扩增引物的扩增程序为：

14、

15、

16、又一方面，本发明提供了一种检测opn1lw和/或opn1mw基因单倍体型的方法，所述的包括以下步骤：

17、s1、提取样本中的dna；

18、s2、利用权利要求1中所述的第一轮扩增引物以步骤s1的dna为模板进行第一轮扩增，获得第一轮扩增产物；第一轮扩增opn1lw和/或opn1mw基因簇的第一个基因。

19、s3、回收步骤s2的第一轮扩增产物；

20、s4、利用权利要求1中所述的第二轮扩增引物以步骤s3回收的第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增，获得第二轮扩增产物；

21、s5、对步骤s3的第二轮扩增产物进行sanger测序；

22、s6、判定opn1lw和/或opn1mw基因单倍体型(p.153/p.171/p.174/p.178/p.180位置的氨基酸类别缩写)及其基因来源。

23、所述的opn1lw基因mrna参考序列为nm_020061.6，所述opn1mw基因mrna参考序列为nm_000513.2。

24、具体地，所述的步骤s1的样本可以是口腔拭子、新鲜组织、血斑或外周静脉血。

25、优选地，所述的步骤s1的样本可以是外周静脉血。

26、具体地，所述的步骤s2的第一轮扩增的体系可以是：

27、 试剂名称 浓度 体积/μl 扩增预混液1 2× 25 f-seq id no.1 5-10μm 1 r-seq id no.2 5-10μm 1 模板dna 1-20ng/μl 5 无核酶水 / 补至50μl

28、；

29、所述的seq id no.1和seq id no.2只扩增opn1lw和/或opn1mw基因簇的第一个基因，因此检测的单倍体型来源于opn1lw和/或opn1mw基因簇的第一个基因。

30、所述的扩增预混液1为扩增缓冲液、mg2+或热启动酶中的一种或多种。

31、优选地，所述的步骤s2的第一轮扩增的体系为：

32、 试剂名称 浓度 体积/μl 扩增预混液1 2× 25 f-seq id no.1 8-10μm 1 r-seq id no.2 8-10μm 1 模板dna 5-10ng/μl 5 无核酶水 / 补至50μl

33、。

34、具体地，所述的步骤s2的第一轮扩增的程序可以是：

35、

36、优选地，所述的步骤s2的第一轮扩增的程序可以是：

37、

38、具体地，所述的步骤s4的第二轮扩增的体系可以是：

39、

40、

41、所述seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6均既可以扩增opn1lw基因，也可以扩增opn1mw基因。

42、所述的扩增预混液2为扩增缓冲液、mg2+或热启动酶中的一种或多种。

43、优选地，所述的步骤s4的第二轮扩增的体系可以是：

44、

45、具体地，所述的步骤s4的第二轮扩增的程序可以是：

46、

47、优选地，所述的步骤s4的第二轮扩增的程序可以是：

48、

49、又一方面本发明提供了前述的试剂在制备opn1lw和/或opn1mw基因单倍体型检测试剂盒中的应用。

50、又一方面本发明提供了一种试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包前述的试剂。

51、具体地，所述的试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

52、本发明所取得的技术效果：

53、(1)检测的准确度高；

54、(2)检测的精密度高；

55、(3)检测的灵敏度高；

56、(4)本发明的检测方法可有效用于指导配镜。