一种干细胞来源外泌体制备方法及其在皮肤修复中的应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体公开了一种干细胞来源外泌体制备方法及其在皮肤修复中的应用。

背景技术：

1、皮肤位于机体的最外层，直接与外界环境接触，能够防止微生物入侵、化学成分危害、紫外线损伤等外部刺激，是机体的第一道防线。由于年龄自然增长，日常护理不到位、化妆品使用不恰当或者过度使用，过渡疲劳和各种意外等因素，很多人出现了皮肤早衰的现象。尤其是面部肌肤，症状包括皮肤干燥粗糙，松弛，皱纹、斑点增加，角质层变薄，易过敏等，然而目前市面少见有效的抗皮肤衰老产品，目前，各种化妆品主要以化学成分为主，再添加了一些植物提取精华素或者其他深海营养物质制备成的美容产品，对皮肤发挥保湿、美白和控油等作用。尽管这些化妆品含有一些营养物质，但因其有效成分含量和有效性等问题，在皮肤再生修复等方面还远远不足。

2、最近的研究发现，外泌体是一种细胞分泌物质，可以通过细胞外囊泡的形式释放到细胞外。近年来研究表明，外泌体在皮肤生物学过程中起着重要作用。

3、首先，外泌体可以调节皮肤的免疫应答。它们可以携带各种免疫分子，例如细胞因子、化学因子和蛋白质，这些分子可以增强或抑制皮肤免疫反应。外泌体还可以与其他细胞相互作用，并调节其免疫功能。

4、其次，外泌体对皮肤细胞的增殖和分化也有影响。它们可以传递生长因子和信号分子，促进皮肤细胞的增殖和分化。此外，外泌体还可以调节角质层的生成和维持，从而保持皮肤的健康状态。

5、最后，外泌体还可以参与皮肤修复和再生过程。它们可以携带各种细胞因子和信号分子，促进受损皮肤的修复和再生。这些分子可以促进新的血管生成，增加胶原蛋白的合成和降解，从而促进皮肤组织的修复和再生。

6、但是外泌体较难的分离和提纯，现有技术中主要的提纯方法有以下几种：

7、(1)差速离心技术，差速离心技术是目前分离外泌体使用最多的提取方法。差速离心技术的原理是根据样品中胞外囊泡密度和尺寸大小的不同，在不同离心力作用下分离出外体。差速离心技术含量低，不需要繁杂的预处理，这一提取技术可广泛提取细胞上清、血清、唾液、尿液以及脑脊液等来源的外泌体样本。然而，差速离心技术可使具有相同质量、密度及大小的外泌体、微囊泡以及蛋白、脂质体等沉积在一起，难以获取完全纯化的外泌体。此外，由于差速离心技术需使用大的离心力，对外泌体的生物学结构会造成一定程度的损伤。

8、(2)尺寸排阻色谱技术，尺寸排阻色谱技术是通过特定材料的孔隙微粒分离含有不同分子量的溶液，现使用的固相多孔隙材料主要有高分子右旋糖苷、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。尺寸排阻色谱技术最大的特点是可以保护外泌体的生物学结构和完整性不受破坏，其次该方法操作简单，节约时间，调整孔隙大小可以得到不同的胞外囊泡亚群。尺寸排阻色谱技术也存在一些缺点，如分离的外泌体中含有与其径粒相似的蛋白质聚合物和脂质体。

9、(3)超滤技术，超滤技术使用超细纳米复合膜对含有不同截流分子量的生物样品进行分离，筛选出外泌体。目前常用的有两种简易的超滤装置，第一种装置是串联配置微孔过滤器；第二种装置是序列超滤过滤器。超滤技术可显著缩短操作时间，不需要特殊的设备，可通过调整超滤膜孔径大小来寻找胞外囊泡的不同子集。然而，超滤膜易堵塞影响分离效率，传统方法可通过蛋白酶清洗超滤膜解决滤膜堵塞的问题，现阶段改进的切向流过滤技术是解决这一问题的理想方法。其次，与外泌体大小相近的纳米粒子可以通过超滤膜是超滤技术的另一个缺陷，因此现在较为常规的使用是将超滤技术与其他技术相结合。

10、(4)聚合物共沉淀试剂盒，聚合物共沉淀技术的原理是亲水性聚合物与样品中外泌体亲水键相互作用，在外泌体周围形成疏水微环境，从而形成沉淀提取出外泌体。现常用的外泌体试剂盒中使用的亲水性聚合物大多是聚乙二醇。聚合物共沉淀技术简单易行，可用于大规模提取外泌体以及疾病的快速诊断。然而，该技术使用的亲水性聚合物不仅可以使外泌体发生沉淀，还可使亲水性物质如核酸、脂蛋白或者一些病毒的沉积，且通过聚合物共沉淀技术提取的外泌体更具有细胞毒性。

11、进一步的，现有的外泌体的提纯保存过程中还存在着缺乏针对性的冻干保护剂的缺点，以及现有的外泌体制剂往往不添加抗炎成分，所以在进行如水光针、皮肤微针等项目时，造成的表皮创口往往有红肿发炎的症状，恢复期较长且有细菌感染的可能的缺陷。

技术实现思路

1、为了解决上述外泌体提纯和保存以及应用过程中的缺陷，本发明公开了一种干细胞来源外泌体制备方法及其在皮肤修复中的应用。

2、本发明包括以下技术方案：

3、一种干细胞来源外泌体制备方法，包括以下步骤：

4、(1)人间充质干细胞培养；

5、(2)收集人间充质干细胞培养基上清液；

6、(3)离心去除培养基上清液中的细胞碎片、凋亡小体等杂质；

7、(4)用真空式过滤器过滤步骤(3)处理后的培养基上清液；

8、(5)用超滤管超滤步骤(4)处理后的培养基上清液，收集内管底部的外泌体浓缩液；

9、(6)配置冻干保护剂；

10、(7)用冻干保护剂重悬步骤(5)处理后得到的外泌体浓缩液；

11、(8)冻干步骤(7)处理后得到的外泌体重悬液，得到外泌体冻干粉。

12、进一步的，上述一种干细胞来源外泌体制备方法，所述步骤(1)中，培养和传代过程中使用无动物源培养基和无动物源胰酶消化液。

13、进一步的，上述一种干细胞来源外泌体制备方法，所述步骤(2)中，待细胞汇合度80％时再继续培养48h后用移液管收集细胞培养基上清液。

14、进一步的，上述一种干细胞来源外泌体制备方法，所述步骤(3)中，培养基上清液以3000g离心30分钟后，取离心后的上清液装入新的离心管中，并弃去沉淀。

15、进一步的，上述一种干细胞来源外泌体制备方法，所述步骤(4)中，将步骤(3)处理后的培养基上清液倒入0.22μm真空式过滤器上杯中，将抽吸管插上真空式过滤器吸嘴，打开抽吸器开关，可以看到上杯中的液体经过滤膜进入下层收集瓶内，收集下层收集瓶内的液体。先用220μm真空式过滤器过滤上清液可以有效降低后续超滤管中超滤膜的堵塞情况，进一步提高超滤效率。

16、进一步的，上述一种干细胞来源外泌体制备方法，所述步骤(5)中，将步骤(4)收集瓶内的液体分装在超滤管中3000g离心45分钟后，收集超滤管内管中的外泌体浓缩液200-300μl；所述超滤管规格为内管15ml，外管50ml，截留分子量100k。

17、进一步的，上述一种干细胞来源外泌体制备方法，所述步骤(6)中，冻干保护剂成分为：0.5-5g海藻糖、30-50mg人血白蛋白、0.1-1g精氨酸；将上述物质溶于100ml生理盐水中。本冻干保护剂可有效保护外泌体在冻干机内逐渐冻干的过程中保持完整的形态，不会因温度、ph值、气压的变化而破裂。

18、进一步的，上述一种干细胞来源外泌体制备方法，所述步骤(7)中，用9.7-9.8ml步骤(6)中配置的冻干保护剂重悬200-300μl步骤(5)中收集的外泌体浓缩液。

19、进一步的，上述一种干细胞来源外泌体制备方法，所述步骤(8)中，将外泌体重悬液于37℃条件下平衡30min，然后将外泌体重悬液于-80℃条件下预速冻12h，再于-40℃，10pa条件下冷冻干燥24h，制得外泌体冻干粉。

20、进一步的，本发明公开了一种包含人间充质干细胞外泌体的可用于面部皮肤修复的制剂，包括消炎成分、生理盐水和采用权利要求1-9中任一项方法制得的外泌体冻干粉；所述冻干粉、消炎成分和生理盐水的料液比为0.3-0.5g:1-2g:97.5-98.7ml。本面部修复制剂额外添加了生物活性成分，具有一定的活性滋养效果，在皮肤中留存、作用的时间更久；且该生物活性物质在生产过程中没有使用任何动物源成分，免疫原性非常低，不易过敏；同时添加一定的消炎成分可辅助减少面部炎症的发生，或进一步修复面部皮肤已有的炎症问题。

21、进一步的，上述一种包含人间充质干细胞外泌体的可用于面部皮肤修复的制剂，所述消炎成分为甘草酸二钾和烟酰胺，其在最终制剂中的浓度分别为0.5-1wt％，0.5-1wt％。甘草酸二钾在化妆品中有广泛的配伍性，常与其它活性剂共用，可加速皮肤对它们的吸收而增效，可用于防晒、协助美白、止痒、调节皮脂、抗过敏等。可防止皮肤炎、皮肤干燥、日晒、皮疹、润喉等。是常见的的祛斑剂，抗过敏剂，常添加于护肤水、祛斑霜膏、乳液制品中。烟酰胺是烟酸的酰胺化合物，是美容皮肤科学领域公认的皮肤抗美白成分。但它的作用也不仅仅局限于美白，烟酰胺是一种“万金油”成分。作为一种医药成分来说具有很高的安全性，也是临床皮肤科治疗中的一种基础性维生素类补充剂，用于防治糙皮病及口炎、舌炎等病症的治疗。烟酰胺熟知的是其美白功效，和常见的抑制络氨酸酶的美白机制不同，它主要通过抑制黑素小体从黑素细胞传到角质细胞，换言之就是切断黑色素的转移路径达到美白的效果。另外还能加速黑色素角质先陈代谢，加强其美白效果；烟酰胺还能够维持肌肤含水量，促进真皮层微循环，增强皮肤屏障。

22、相比现有技术，本发明具有如下突出的有益效果：

23、(1)成本低，现有技术中使用超速离心设备提纯细胞培养上清液成本约为￥10-15/ml，使用切向流过滤法提纯细胞培养上清液成本约￥3-5/ml，本方法提纯细胞培养上清液成本约￥2-3/ml；

24、(2)规模大，除了切向流过滤技术以外，现有别的方法一次提纯细胞培养上清液的量为每次20-100ml，本发明用一台离心机最多可一次提纯240ml细胞培养上清液；

25、(3)提取效率高，通过我们的验证，市面上常见的外泌体分离试剂盒或外泌体分离柱产品的外泌体分离效率往往低于60％，而本方法外泌体分离效率为65％-85％；

26、(4)本发明易控制无菌，而现有技术的处理流程或处理设备体积都较大，除gmp车间以外无法在细胞间无菌条件下进行操作；

27、(5)本面部修复制剂相较于市面上常见的面部美容制剂，额外添加了生物活性成分，具有一定的活性滋养效果，在皮肤中留存、作用的时间更久；且该生物活性物质在生产过程中没有使用任何动物源成分，免疫原性非常低，不易过敏；同时添加一定的消炎成分可辅助减少面部炎症的发生，或进一步修复面部皮肤已有的炎症问题。