一种多重病媒DNA测序分析方法与流程

本发明涉及临床诊断，具体为一种多重病媒dna测序分析方法。

背景技术：

1、随着生物技术的快速发展，dna测序技术已成为研究生物遗传信息、疾病诊断及预防等领域的重要手段。然而，现有的dna测序技术，特别是在针对多重病媒(如细菌、病毒、寄生虫等)的检测上，存在诸多不足。例如，传统的pcr方法只能针对单一目标进行检测，无法满足快速、准确地同时检测多种病原体的需求；而高通量测序虽然可以同时检测多种病原体，但成本高昂，且数据处理复杂。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种多重病媒dna测序分析方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多重病媒dna测序分析方法，包括以下步骤：

3、采集待检测样本，并通过磁珠法提取待检测样本内的dna。

4、根据目标病原体的基因序列信息，设计特异性引物；

5、在同一反应体系中，加入试剂，进行多重pcr扩增；

6、将多重pcr扩增产物进行纯化、末端修复、加a尾和连接接头处理，构建成测序文库；

7、采用第二代测序技术，对测序文库进行测序；

8、利用生物信息学分析软件，对测序数据进行比对和分析，根据比对结果，判断待检测样本中是否存在目标病原体，并确定其种类和数量。

9、优选地，所述采集待检测样本，并提取待检测样本内的dna，包括：

10、采集待检测样本，并对样本进行预处理；

11、将样本与裂解液混合，释放核酸；

12、向裂解后的样本中加入带有特定电荷或亲和性的磁珠，等待磁珠与dna结合，形成磁珠-dna复合物；

13、通过多次洗涤，去除与dna结合的蛋白质、细胞碎片等杂质，纯化磁珠-dna复合物；

14、使用洗脱液将dna从磁珠上洗脱下来，收集洗脱液中的dna。

15、优选地，所述根据目标病原体的基因序列信息，设计特异性引物，包括：

16、根据目标病原体的基因序列信息，确定需要扩增的特定序列或基因区域；

17、使用primer3、oligo来设计特异性引物。

18、优选地，所述在同一反应体系中，加入试剂，进行多重pcr扩增，包括：

19、准备好试剂，包括目标病原体特异性引物、dna模板、taq dna聚合酶、dntp混合物、缓冲液、mg2+和双或三蒸水；

20、按照pcr反应体系的要求，将试剂按照目标比例混合在一起，得到多重pcr反应体系；

21、将配置好的多重pcr反应体系放入pcr仪中，并设置好pcr仪的程序参数；

22、按照设定的程序参数，启动pcr仪进行多重pcr扩增。

23、优选地，所述试剂的目标比例为：

24、缓冲液：5～10ul，dntp混合物：180～200umol/，引物：10～100pmol，dna模板：0.1～2ug，taq dna聚合酶：2.5～5u，mg2+：1.2～1.6mmol/l，余量为双或三蒸水。

25、优选地，所述将多重pcr扩增产物进行纯化、末端修复、加a尾和连接接头处理，构建成测序文库，包括：

26、对多重pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

27、然后通过产物纯化试剂盒对pcr扩增产物进行纯化；

28、然后通过酶补平pcr扩增过程中产生的不平整末端；

29、在补平末端后，在dna片段的3’端添加一个a碱基；

30、然后设计接头，并将接头与dna片段进行连接，并获取测序文库。

31、优选地，所述对测序文库进行测序，包括：

32、准备好测序芯片；

33、将测序文库加入到测序芯片上并固定；

34、在测序芯片上，通过桥式pcr技术扩增dna片段；

35、然后使用四种不同颜色的荧光标记的dntps和dna聚合酶进行测序，获取测序数据。

36、优选地，所述利用生物信息学分析软件，对测序数据进行比对和分析，根据比对结果，判断待检测样本中是否存在目标病原体，并确定其种类和数量，包括：

37、对测序数据进行预处理，包括质量控制和序列过滤；

38、根据实验目的和测序数据类型，选择比对软件，准备包含目标病原体基因组的参考数据库，将预处理后的测序数据提交给比对软件，并设置比对参数；

39、对比对结果进行统计，根据比对结果，判断待检测样本中是否存在目标病原体，若待检测样本中存在目标病原体，则进一步确定其种类和数量；

40、将比对结果生成报告进行可视化展示。

41、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

42、通过采用先进的生物信息学分析算法和引物设计软件，能够设计出高度特异性的引物，从而实现精准、高效的目标病原体检测，该方法不仅提高了检测的准确性，减少了非特异性扩增的可能性，还显著提升了检测效率，降低了实验成本，同时，由于引物的特异性增强，使得检测结果更加可靠，为疾病的早期诊断和防控提供了有力支持，此外，该方法还具有高度的灵活性和可扩展性，适用于多种不同类型的病原体检测。

技术特征：

1.一种多重病媒dna测序分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采集待检测样本，并提取待检测样本内的dna，包括：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据目标病原体的基因序列信息，设计特异性引物，包括：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在同一反应体系中，加入试剂，进行多重pcr扩增，包括：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂的目标比例为：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将多重pcr扩增产物进行纯化、末端修复、加a尾和连接接头处理，构建成测序文库，包括：

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对测序文库进行测序，包括：

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用生物信息学分析软件，对测序数据进行比对和分析，根据比对结果，判断待检测样本中是否存在目标病原体，并确定其种类和数量，包括：

技术总结本发明公开了一种多重病媒DNA测序分析方法,涉及临床诊断技术领域。所述方法包括：采集待检测样本，并通过磁珠法提取待检测样本内的DNA；根据目标病原体的基因序列信息，设计特异性引物；在同一反应体系中，加入试剂，进行多重PCR扩增；将多重PCR扩增产物进行纯化、末端修复、加A尾和连接接头处理，构建成测序文库。本发明通过采用先进的生物信息学分析算法和引物设计软件，能够设计出高度特异性的引物，从而实现精准、高效的目标病原体检测，该方法不仅提高了检测的准确性，减少了非特异性扩增的可能性，还显著提升了检测效率，降低了实验成本。技术研发人员：曹琳,梁宏,梁慧杰,于波,张凤娟,陈琳琳受保护的技术使用者：曹琳技术研发日：技术公布日：2024/9/9