人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株PC-9OR及其应用的制作方法

本发明涉及一种人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or及其应用，属于生物医药。

背景技术：

1、据2023美国癌症协会数据报告，肺癌仍是目前人类死亡率最高（男性21%，女性21%）的肿瘤。肺癌的恶性程度较高，病情进展较快，超过70%的患者在确诊时已出现局部或远隔器官的转移，从而失去了手术治疗的最佳时机。

2、非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer）是肺癌中最常见的类型。据统计，非小细胞肺癌占肺癌总数的80%-85%，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermalgrowth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, egfr-tki）已成为表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, egfr）基因敏感突变患者的一线标准治疗。flaura研究结果显示，与传统化疗药物顺铂相比，第一代egfr-tki药物吉非替尼、厄洛替尼，第二代 egfr-tki药物阿法替尼、达克替尼，中位无疾病进展生存期在10~14个月。奥希替尼作为全球首个三代egfr-tki靶向药，不仅对egfr 19外显子缺失突变和21外显子l858r突变患者有较好的敏感性，且对于前期使用第一代与第二代egfr-tki后产生egfr 20外显子t790m突变的患者也具有较好疗效，一线使用奥希替尼中位无疾病进展生存期可达18.9个月。奥希替尼自2017年进入中国，相继获批了局部晚期或转移性非小细胞肺癌成人患者的二线治疗及一线治疗适应症。尽管奥希替尼临床疗效显著，但获得性耐药仍不可避免，最终将导致肺癌进一步进展而影响患者总体生存期。

3、目前，国内外文献报道中可见肿瘤耐药细胞株的基础研究，但对奥希替尼耐药肺癌细胞株的研究中，主要为h1975肺腺癌细胞株，此细胞株伴有21外显子l858r突变 、egfrt790m突变，且研究多提示需大于6个月尚能建立稳定的耐药细胞株并进行后续基础研究。而一项来自亚洲的多中心前瞻性研究pioneer发现，在iiib-iv期的肺腺癌患者中，egfr 19外显子缺失在egfr所有突变类型中比例较高可达到22.1%，因此，针对egfr 19外显子缺失突变的亚洲人群中肺腺癌患者的耐药机制研究尤其重要。本发明选用肺腺癌细胞株为pc-9，其伴有egfr 19外显子缺失突变。除此之外，目前尚无商品化的奥希替尼耐药细胞株可供基础研究选择。因此，需要一种诱导周期短、体系稳定的方法以助力egfr 19号外显子缺失突变患者奥希替尼耐药机制的研究，进一步寻找克服奥希替尼耐药的有效治疗方法，并指导临床用药。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，成功构建了携带 egfr19外显子缺失突变的非小细胞肺癌pc-9 or耐药株，命名为人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or，为研究非小细胞肺癌对靶向药耐药机制、寻找克服非小细胞肺癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，对模拟非小细胞肺癌奥希替尼耐药过程并深入明确nsclc 奥希替尼耐药机制具有重要意义。

2、为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：

3、本发明提供一种人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or，所述人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or于2024年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：c202453，保藏地址：中国武汉市武汉大学。

4、本发明以非小细胞肺癌细胞pc-9为诱导对象，首先采用25nm的奥希替尼药物持续处理处于对数生长期的非小细胞肺癌细胞，诱导驯化培养4个月；通过细胞形态学观察、药物敏感和耐药性试验，并进一步通过人全基因组重测序技术，评价非小细胞肺癌对奥希替尼细胞株的生物学特性，成功构建了携带 egfr19外显子缺失的非小细胞肺癌pc-9 or耐药株，命名为人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or。

5、本发明构建得到的非小细胞肺癌对奥希替尼耐药细胞株的耐药倍数在100倍以上，可在作用浓度为1μm奥希替尼的培养体系中稳定生长、传代，对奥希替尼的耐药倍数（ri）为116倍。

6、本发明还提供上述奥希替尼耐药细胞株在筛选逆转肿瘤耐药性药物中的应用、在制备抗肿瘤药物中的应用以及在构建奥希替尼耐药的肿瘤细胞模型中的应用。

7、优选的，所述肿瘤为肺癌。

8、进一步优选的，所述肺癌为非小细胞癌，更具体的，所述非小细胞癌为肺腺癌。

9、与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：

10、目前，肺癌在我国男、女恶性肿瘤患者中发病和死亡顺位中均居首位，egfr是非小细胞肺癌的常见突变靶点，其在亚裔人群中的发生率高达40%-60%，靶向治疗虽然显著改善了伴有egfr突变患者的预后，但egfr-tki治疗最终仍会产生耐药，而对耐药后的治疗却面临着瓶颈。

11、本发明以肺腺癌患者为研究对象，以egfr为研究切入点，选择亚洲人群中egfr 19外显子缺失突变比例发生较高的患者为研究内容，考虑目前尚无商品化的奥希替尼耐药细胞株可供基础研究选择。因此，本发明专利构建了一种伴有egfr 19外显子缺失突变的奥希替尼一线耐药细胞株，耐药倍数在100倍以上，可在作用浓度为1μm 奥希替尼的培养体系中稳定生长、传代，对奥希替尼的耐药倍数(ri) 为116倍。本发明专利中诱导奥希替尼耐药耗时4个月，相对现有研究中耗时6个月以上，总体周期短，本研究同时通过人全基因组重测序方法进一步证实耐药细胞株遗传背景出现变化，是一株新的细胞株。

12、通过对耐药细胞株的研究，结果提示，耐药细胞株中仍存在egfr 19外显子缺失突变，未发现继发egfr 20外显子t790m突变，细胞增殖实验可见耐药细胞株增殖减慢，但侵袭能力增强，另外，western-blotting结果提示，耐药细胞株中程序性死亡配体1（pd-l1）表达出现了明显降低，因此egfr 19外显子缺失突变患者一线使用奥希替尼耐药后建议进一步行二次组织活检，同时进行免疫组化明确pd-l1的表达情况，临床中若单独使用抗pd-l1免疫治疗风险较大，可联合化疗治疗。

13、本发明主要以egfr 19外显子缺失突变为研究内容，进一步探索奥希替尼在此类患者人群中的耐药机制，寻找克服奥希替尼耐药的有效治疗方法，并指导临床用药，对进一步开发抗肿瘤药物等均具有重要意义。

技术特征：

1.一种人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or，其特征在于，所述人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or于2024年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：c202453。

2.权利要求1所述的人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or在筛选逆转肿瘤耐药性药物中的应用。

3.权利要求1所述的人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1所述的人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株pc-9 or在构建奥希替尼耐药的肿瘤细胞模型中的应用。

5.根据权利要求2~4任一项所述应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞癌。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述非小细胞癌为肺腺癌。

技术总结本发明公开了一种生物医药技术领域的人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株PC‑9 OR及其应用，旨在解决现有技术中尚无商品化的奥希替尼耐药细胞株等问题，所述奥希替尼耐药细胞株为人肺腺癌奥希替尼耐药细胞株PC‑9 OR，保藏号为CCTCC NO：C202453。本发明为研究非小细胞肺癌对靶向药耐药机制、寻找克服非小细胞肺癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，对模拟非小细胞肺癌奥希替尼耐药过程并深入明确NSCLC奥希替尼耐药机制具有重要意义。技术研发人员：潘雪,施敏骅受保护的技术使用者：核工业总医院技术研发日：技术公布日：2024/9/9