一种红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状相关的表观遗传标记及其应用

本发明涉及分子育种，更具体地，涉及一种红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状相关的表观遗传标记及其应用。

背景技术：

1、红罗非鱼(oreochromis spp.)隶属于鲈形目perciformes，丽鱼科cichlidae，罗非鱼属(tilapia)，是尼罗罗非鱼和莫桑比克罗非鱼杂交以及多代选育后的优势突变种。红罗非鱼体色较为丰富有红色、橙色、金色、粉红色、橘黄色等。同时，红罗非鱼还具有生长速度快、繁殖周期短、适应盐度广、对复杂养殖系统适应性强、经济价值高以及体表色彩鲜艳体内腹腔无黑膜等特点，进而被东南亚和我国等地广泛的养殖。体色是鱼类重要的经济价值之一，红罗非鱼有着鲜艳的体色，广泛的受到消费者的喜爱。

2、在红罗非鱼的工厂化实际养殖过程中，一部分红罗非鱼在经历越冬期会出现体色黑斑变异的现象，其表现为在早期时主要集中在鱼体下腹部、尾鳍、臀鳍位置出现弥散状的黑色斑点，随着越冬期时间的进程，该黑色斑点会逐渐密集并随着向全身蔓延，同时黑色斑点会聚集成块并颜色加深。越冬期结束后会伴随着黑斑逐渐减弱，但不会消失。因此，红罗非鱼体表出现的黑斑变异现象，极大的影响了其经济价值，也制约了其规模化工厂养殖。但是，目前对于红罗非鱼体色黑斑变异的环境因素和遗传因素还尚不明确，同时由于红罗非鱼遗传背景的复杂性、自交不亲和性等特征极大的限制了其优良品系的遗传育种以及新品种的选育。

3、因此，能够有效的筛选出越冬期体色无黑斑变异且稳定遗传的红罗非鱼对于解决当前红罗非鱼工厂化养殖所面临的问题以及提高其经济价值是至关重要的。现有的技术关于对于红罗非鱼体色进行筛选主要是关注于对分子标记的应用，如中国发明专利《红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其应用》，该发明提供两对与红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星检测引物；中国发明专利《一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的方法》，通过对黑斑性状进行qtl定位并在lg3_11647206该位置找到了与黑斑性状全基因组显著水平相关的snp突变位点。但是目前关于红罗非鱼体色育种的筛选还是关注于传统育种手段。

4、表观遗传学是研究环境因素如何通过改变基因的表达而不改变dna序列的信息传递机制的科学；这些改变包括dna甲基化、组蛋白修饰、rna相关的机制，这些都可以影响基因的表达。dna甲基化是表观遗传修饰中研究最广泛最深入的dna碱基的生物化学修饰，它是一种异常保守的表观遗传机制，能够在不改变基因组碱基序列的基础上改变细胞内转录组的表达水平并造成表型上的差异，同时dna甲基化具有组织特异性、稳定可变的序列和可跨代遗传的特性。表观遗传育种是近年来兴起的一种育种方法，它是在传统遗传育种的基础上，加入了对表观遗传信息的考量。因此它能够更快的加快育种进程并获得优良的性状；同时由于表观遗传标记反映了环境对基因表达的影响，进而能够更准确的选择育种目标；以及增加了遗传的变异性帮助克服育种过程中的局限性和通过表观遗传标记选择在环境变化中表现稳定的特征改良了性状的稳定性。

5、表观遗传育种目前主要应用于作物和畜牧动物的改良。在作物育种中，通过表观遗传标记的选择来提高作物的产量、耐逆境能力等。在畜牧动物改良中，通过选择那些表观遗传标记有利的个体，可以提高肉质、奶质、繁殖能力等。关于表观遗传育种依然处于研究和发展阶段，但是随着高通量测序技术、表观基因组学和生物信息学的快速发展，表观遗传育种的应用前景极为广阔。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状相关的表观遗传标记及其应用。

2、表观遗传学是研究环境因素如何通过改变基因的表达而不改变dna序列的信息传递机制的科学。根据该科学近年来兴起的一种新的育种方法即表观遗传育种，它是在传统遗传育种的基础上，加入了对表观遗传信息的利用。本发明通过在越冬期容易发生黑斑性状变异相关的dna甲基化修饰标记，筛选出体色不变异性状稳定的红罗非鱼，避免因黑斑性状影响红罗非鱼的经济效益，以及筛选出红罗非鱼越冬期体色性状稳定的红罗非鱼亲鱼。

3、本发明的第一个目的是提供一种红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状相关的表观遗传标记。

4、本发明的第二个目的是提供所述的表观遗传标记和/或其检测试剂在检测红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状中的应用。

5、本发明的第三个目的是提供所述的表观遗传标记检测试剂在制备检测红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状的试剂盒中的应用。

6、本发明的第四个目的是提供一种检测红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状的方法。

7、本发明的第五个目的是提供一种检测红罗非鱼越冬期黑斑变异性状的试剂盒。

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

9、本发明要求保护一种红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状相关的表观遗传标记，所述表观遗传标记位于lg3：11575201～11575800，参考基因组为gca_001858045.3。

10、优选地，表观遗传标记为cpg1到cpg13，其中cpg1位于chrlg3：11575499、cpg2位于chrlg3：11575510、cpg3位于chrlg3：11575531、cpg4位于chrlg3：11575533、cpg5位于chrlg3：11575552、cpg6位于chrlg3：11575589、cpg7位于chrlg3：11575599、cpg8:11575617、cpg9位于chrlg3：11575630、cpg10位于chrlg3：11575667、cpg11位于chrlg3：11575683、cpg12位于chrlg3：11575722和cpg13位于chrlg3：11575732。

11、还要求保护，所述的表观遗传标记和/或其检测试剂在检测红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状中的应用。

12、以及，所述的表观遗传标记检测试剂在制备检测红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状的试剂盒中的应用。

13、优选地，所述试剂为引物。

14、更优选地，所述引物的核苷酸序列如seq id no 1和2所示。

15、seq id no 1：5’-taggtgtgaatgtgagtgtgaatgg-3’；

16、seq id no 2：5’-caatcaaaattaacaccaaccccct-3’。

17、本发明还要求保护，一种检测红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状的方法，对待测样本的dna进行亚硫酸氢盐处理，之后检测所述的表观遗传标记，根据其甲基化程度判断越冬期黑斑变异情况。

18、优选地，表观遗传标记为cpg1到cpg13，其中cpg1位于chrlg3：11575499、cpg2位于chrlg3：11575510、cpg3位于chrlg3：11575531、cpg4位于chrlg3：11575533、cpg5位于chrlg3：11575552、cpg6位于chrlg3：11575589、cpg7位于chrlg3：11575599、cpg8:11575617、cpg9位于chrlg3：11575630、cpg10位于chrlg3：11575667、cpg11位于chrlg3：11575683、cpg12位于chrlg3：11575722和cpg13位于chrlg3：11575732。

19、13个cpg位点中，每个cpg位点甲基化水平都高于50％的个体为越冬期体色稳定没有黑斑的红罗非鱼，每个cpg位点甲基化水平都低于25％的个体是越冬期体色发生黑斑变异的红罗非鱼。

20、优选地，使用seq id no 1和2所示引物进行检测。

21、seq id no 1：5’-taggtgtgaatgtgagtgtgaatgg-3’；

22、seq id no 2：5’-caatcaaaattaacaccaaccccct-3’。

23、本发明还要求保护，一种检测红罗非鱼越冬期黑斑变异性状的试剂盒，含有所述的表观遗传标记检测试剂。

24、优选地，还含有dna亚硫酸氢盐处理试剂和/或pcr扩增试剂。

25、优选地，所述试剂检测所述的表观遗传标记的甲基化水平。

26、优选地，使用seq id no 1和2所示引物进行检测。

27、seq id no 1：5’-taggtgtgaatgtgagtgtgaatgg-3’；

28、seq id no 2：5’-caatcaaaattaacaccaaccccct-3’。

29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

30、本发明提供一种红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状相关的表观遗传标记，并进一步利用该表观遗传标记开发了检测引物和判断红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状的方法。该方法可以应用于红罗非鱼越冬期发生体色黑斑变异的筛选，选取遗传性状稳定的红罗非鱼作为亲鱼，应用于红罗非鱼的表观遗传育种。

31、因此，通过利用红罗非鱼越冬期体色黑斑变异性状相关的表观遗传标记，为其表观遗传育种提供了新的思路和方法，在改良红罗非鱼体色黑斑变异性状提供新的方案。