产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法和治疗用途

背景技术：

1、(地尼白介素-2(denileukin diftitox))是一种含521个氨基酸的重组dna源性细胞毒性蛋白，由白喉毒素片段a和一部分片段b的氨基酸序列(met1-his388)以及人白介素-2的序列(il-2；ala1-thr133)组成。它当前在大肠埃希氏菌(e.coli)表达系统中产生，并且具有58kd的分子量。新霉素用于发酵过程中，但在最终产品中不可检测。以意图用于静脉内(iv)施用的无菌冷冻溶液形式提供在单次使用小瓶中的在1999年由fda核准用于治疗皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)。由于关于在最终制剂中存在具有异质分子量的蛋白质聚集物、过量残余dna和过量残余清洁剂的担忧，fda在2011年6月将置于临床暂停状态。的产生通过在大肠埃希氏菌细胞质中表达重组蛋白来实现，而这个表达系统产生形成包含多肽的大型不溶性聚集物或所谓包涵体的重组蛋白。在包括使包涵体形式变性和再折叠的当前生产过程中，具有异质分子量的蛋白质聚集物仍然存在于最终制剂中。在纯化形式中存在这些聚集物是使用大肠埃希氏菌源性细胞质包涵体作为多肽的来源的结果，并且是由于即使在吐温20(tween 20)存在下毒素的跨膜结构域也具有内在疏水性质。使用这个方法产生的将在下文中被称为经典或

2、此外，如同所有细菌毒素和植物毒素一样，携带诱发血管渗漏综合征(vls)的氨基酸基序。约30％的用治疗的患者显现在伴有快速重量增加的外周水肿至低白蛋白血症至肺水肿的范围内的vls症状。需要的是1)使得能够以高产率和纯度产生ontak样蛋白、从而消除最终商业产品中的聚集物的方法，和2)伴有最小vls副作用以向患者提供更安全药物的经修饰的ontak样蛋白。

技术实现思路

1、本发明的一个实施方案是一种dna表达载体，其包含：toxp；阻断fe介导的基因表达调控的突变toxo；和编码蛋白质的dna序列，其中所述toxp和所述突变toxo调控编码所述蛋白质的dna区段的表达。优选的是本发明的dna表达载体包含编码信号肽的dna序列，以使从dna表达载体表达出的蛋白质连接于通常被裂解去除以形成成熟蛋白质的所述信号肽。优选突变toxo是seq idno:1，并且优选信号肽是seq id no:5。本发明的dna表达载体可用于产生许多种类的蛋白质诸如crm 197和crm 107或其组合。crm蛋白序列以seq id no:18-21加以说明。优选的是本发明的dna表达载体编码白喉毒素或其功能性部分，其连接于受体结合蛋白或其功能性部分以形成白喉毒素受体融合蛋白。所述融合蛋白的受体结合蛋白部分可选自包括以下的组：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-15、egf、fgf、p物质、cd4、αmsh、grp、tt片段c、gcsf、调蛋白β1(heregulinβ1)、其功能性部分或其组合。白喉毒素融合蛋白的实例包括以seq id no:11-15中的任一者加以说明的蛋白。

2、本发明的另一实施方案是一种dna表达载体，其包含：toxp；阻断fe介导的基因表达调控的突变toxo；编码蛋白质的dna序列，所述蛋白质包含信号序列；白喉毒素或其功能性部分，其不含白喉受体结合结构域或具有非功能性白喉毒素受体结合结构域；和选自包括以下的组的靶标受体结合结构域：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-15、egf、fgf、p物质、cd4、αmsh、grp、tt片段c、gcsf、调蛋白β1、其功能性部分或其组合，其中所述toxp和所述突变toxo调控编码所述蛋白质的所述dna序列的表达。通常，用本发明的dna表达载体转化的细菌产生连接于信号肽的白喉毒素受体结合融合蛋白，其由所述信号肽引导至周质、培养基或这两个位置。如果细菌是大肠埃希氏菌，那么信号肽通常将白喉毒素受体结合融合蛋白引导至周质。如果细菌是白喉棒杆菌(corynebacterium diphtheria)，那么信号肽将白喉毒素受体结合融合蛋白引导至培养基。优选的是本发明的dna表达载体包含seqid no:3，并且可包含编码可裂解蛋白质标签的dna，其中所述可裂解蛋白质标签连接于白喉毒素受体结合融合蛋白。由本发明的dna表达载体产生的白喉毒素受体结合融合蛋白的实例包括seq idno:11至15中的任一者。

3、本发明的另一实施方案包括一种用于产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明的dna表达载体转化细菌；形成转化体；在培养基中孵育所述转化体以使分泌至所述培养基中的蛋白质表达；以及从所述培养基纯化所述蛋白质。用于这个方法中的优选细菌是白喉棒杆菌。

4、本发明的另一实施方案包括一种用于产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法，其包括以下步骤：1)用dna载体转化白喉棒杆菌菌株，所述dna载体包含：toxp；阻断fe介导的基因表达调控的突变toxo；编码蛋白质的dna序列，所述蛋白质包含：信号肽；白喉毒素或其功能性部分，其不含白喉受体结合结构域或具有非功能性白喉毒素受体结合结构域；和选自包括以下的组的靶标受体结合结构域：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-15、egf、fgf、p物质、cd4、αmsh、grp、tt片段c、gcsf、调蛋白β1、tnfα、tgfβ、其功能性部分或其组合，其中所述toxp和所述突变toxo调控编码所述蛋白质的所述dna序列的表达；2)形成转化体；3)在培养基中孵育所述转化体以使所述蛋白质表达，并且其分泌至所述培养基中；和4)从所述培养基纯化所述白喉毒素融合蛋白。通过本发明方法产生的白喉毒素受体融合蛋白的实例包括seqid no:11至15中的任一者。用于本发明方法中的优选白喉棒杆菌菌株是棒杆菌c7β(-),tox(-)。

5、本发明的另一实施方案包括一种治疗患有结核病的患者的方法，其包括以下步骤：制备如本技术中提供的白喉毒素融合蛋白；向患有结核病的患者施用所述白喉毒素融合蛋白。

6、本发明的另一实施方案包括一种包含突变toxo启动子的dna表达载体。

7、本发明的另一实施方案包括一种含有本发明的dna表达载体的白喉棒杆菌菌株。

8、本发明的另一实施方案是制备蛋白质的方法，其包括以下步骤：提供dna表达载体，其包含toxp、阻断fe介导的基因表达调控的突变toxo、信号序列和编码蛋白质的dna序列；用所述dna载体转化细菌菌株以形成转化体；在培养基中孵育所述转化体持续一段时期以使分泌至所述培养基中的蛋白质表达；以及从所述培养基纯化所述蛋白质。

9、本发明的另一实施方案是一种选自seq id no:11-15中的任一者的融合蛋白。

10、本发明的另一实施方案是一种包含上述融合蛋白的药物组合物。

11、本发明的另一实施方案是一种药物组合物，其包含上述融合蛋白和至少一种或多种其他化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括异烟肼(isoniazid)、利福平(rifampin)、利福布丁(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素(streptomycin)、阿米卡星(amikacin)、卡那霉素(kanamycin)、乙硫异烟胺(ethionamide)、丙硫异烟胺(protionamide)、特立齐酮(terizidone)、氨硫脲(thiacetazone)、环丝氨酸(cycloserine)、缠霉素(capreomycin)、对氨基水杨酸(pas)、紫霉素(viomycin)、氧氟沙星(ofloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、贝达喹啉(bedaquiline)、或迪拉马尼(delamanid)、利奈唑胺(linezolid)、特地唑胺(tedezolid)、阿莫西林-克拉维酸(amoxicillin-clavulanic acid)、美罗培南(meropenem)、亚胺培南(imipenem)、克拉霉素(clarithromycin)或氯苯吩嗪(clofazimine)。

12、药物组合物包含上述融合蛋白和至少一种或多种其他抗微生物剂。抗微生物剂的实例包括异烟肼、利福平、利福布丁、利福喷丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、卡那霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、特立齐酮、氨硫脲、环丝氨酸、缠霉素、对氨基水杨酸(pas)、紫霉素、氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、贝达喹啉、或迪拉马尼、利奈唑胺、特地唑胺、阿莫西林-克拉维酸、美罗培南、亚胺培南、克拉霉素或氯苯吩嗪。

13、本发明的另一实施方案是一种治疗或预防受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含选自seq id no:11-15中的任一者的融合蛋白的药物组合物。

14、本发明的另一实施方案是一种治疗或预防受试者的结核病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含选自seq id no:11-15中的任一者的融合蛋白的药物组合物。

15、本发明的另一实施方案是一种包含本发明的dna表达载体的原核细胞系。

16、本发明的另一实施方案是包含本发明的dna表达载体的试剂盒。

17、本发明的另一实施方案是一种包含seq id no:2的toxp。

18、本发明的另一实施方案是一种具有seq id no:11至15中的任一者的蛋白质。