具有广谱裂解活性的肽聚糖水解酶LysPH1及其突变体和应用

本发明属于生物制剂，具体涉及一种具有广谱裂解活性的抗菌肽lysph1-cp、肽聚糖水解酶lysph1及其突变体lysph1-k和应用。

背景技术：

1、抗生素曾被认为是治疗细菌感染性疾病最有力的武器，然而随着抗生素的滥用现象日益严重，细菌耐药性问题日益加剧，新抗生素研发的速度远低于耐药菌产生的速度。可作为替代的新抗生素又为数极少，且费用昂贵，造成临床上大量耐药菌感染者因无药可医而死亡，在这样严峻的抗生素耐药形式作用下，作为可替代抗生素成为新型抗菌制剂的噬菌体，引起国内外学者的重视。

2、噬菌体是一类以微生物（细菌、真菌、放线菌或螺旋体）为宿主的病毒，没有细胞结构，仅由衣壳蛋白和其内部的遗传物质组成，必须依赖宿主进行复制和增殖。噬菌体作为细菌的天然杀手，广泛存在于自然界中，是地球上最丰富多样的生物体，它们的数量大约是细菌的10倍。近一个多世纪以来，噬菌体治疗的安全性和有效性已经在大量动物试验中得到了证实。裂解性噬菌体在感染宿主细菌细胞后即立即启动自身早期基因的表达，通过这些早期基因表达产物降解宿主dna，从而终止宿主的基因表达，夺取宿主的dna复制机器大量合成自身核酸；当产生足够的噬菌体后，这些核酸被当作模板产生大量的噬菌体结构蛋白，这些结构蛋白对噬菌体基因组进行加工和包装，产生下一代噬菌体颗粒。一旦噬菌体调控蛋白积累到一定水平，即启动噬菌体的穿孔素大量表达，穿孔素在宿主细胞内形成孔洞，导致噬菌体裂解酶穿过内膜并接近细胞壁，将细胞壁裂解，从而达到裂解细菌的目的。

3、除了完整的噬菌体颗粒可以作为抗菌剂外，噬菌体编码的肽聚糖水解酶-裂解酶（lysin）也是一类极具开发潜力的新型抗菌分子。裂解酶是双链dna噬菌体在感染宿主的后期编码的一类水解酶，可以水解细菌细胞壁肽聚糖，导致细菌裂解并释放子代噬菌体。革兰氏阳性细菌裂解酶有比较系统和成熟的研究，众多天然裂解酶和嵌合裂解酶在动物感染模型中被证实安全有效，其中抗耐药金黄色葡萄球菌感染的多个裂解酶已进入到临床试验阶段。裂解酶的高效性、特异性、低耐药性以及与现有抗生素的协同作用等优势使其成为新的、极具前景的抗菌药物。

4、目前，关于噬菌体裂解酶的应用主要是裂解革兰氏阳性菌，例如：金黄色葡萄球菌、李斯特菌等，对革兰氏阴性菌具有裂解活性的噬菌体裂解酶研究较少。因此，有必要开发新的、对革兰氏阴性菌具有高效裂解活性的噬菌体裂解酶。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有广谱裂解活性的肽聚糖水解酶lysph1及其突变体和应用。本发明中的抗菌肽lysph1-cp、肽聚糖水解酶lysph1和肽聚糖水解酶突变体lysph1-k具有广谱的裂解活性，能广谱裂解革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

2、在第一方面，本发明提供了一种具有广谱裂解活性的抗菌肽lysph1-cp，抗菌肽lysph1-cp的氨基酸序列如seq id no: 1所示。

3、在第二方面，本发明提供了一种具有广谱裂解活性的肽聚糖水解酶lysph1，肽聚糖水解酶lysph1包含上述抗菌肽lysph1-cp，并且肽聚糖水解酶lysph1选自如下任一所示的蛋白质：a1）氨基酸序列如seq id no: 2所示的蛋白质；a2）将如seq id no: 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的变化得到的具有相同功能的蛋白质，其中，变化选自取代、缺失、添加中的至少一种；a3）与a1）-a2）中任一项所限定的氨基酸序列具有90%以上（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性并且具有相同功能的蛋白质。

4、在第三方面，本发明提供了一种具有广谱裂解活性的肽聚糖水解酶突变体lysph1-k，肽聚糖水解酶突变体lysph1-k包含上述抗菌肽lysph1-cp或上述肽聚糖水解酶lysph1；并且肽聚糖水解酶突变体lysph1-k选自如下任一所示的蛋白质：a1）氨基酸序列如seq id no: 3所示的蛋白质；a2）将如seq id no: 3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的变化得到的具有相同功能的蛋白质，其中，变化选自取代、缺失、添加中的至少一种；a3）与a1）-a2）中任一项所限定的氨基酸序列具有90%以上（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性并且具有相同功能的蛋白质。

5、本发明提供的上述抗菌肽lysph1-cp、上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k可以是天然、重组或合成的活性多肽，该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主（例如大肠杆菌）或真核宿主（例如酵母、高等植物）中产生的产物。

6、在一些实施方案中，上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k是通过将含有其编码基因的重组载体导入表达宿主（例如大肠杆菌bl21(de3)）中得到重组基因工程菌株，然后将该重组基因工程菌株进行培养，并进行诱导表达，得到肽聚糖水解酶lysph1或肽聚糖水解酶突变体lysph1-k。

7、在第四方面，本发明提供了编码上述抗菌肽lysph1-cp或上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k的核酸分子，核酸分子选自如下任一所示的核酸分子：b1）具有如seq id no: 4所示、如seq id no: 5所示或如seq id no: 6所示的核苷酸序列的核酸分子；b2）与b1）限定的核酸分子杂交且编码上述抗菌肽lysph1-cp、上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k的核酸分子；b3）与b1）或b2）限定的核酸分子具有90%以上（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的序列同一性且编码上述抗菌肽lysph1-cp、上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k的核酸分子。

8、本发明提供的上述核酸分子通常可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。

9、如本文所用，术语“在严格条件下杂交”是指两个核酸分子片段在如sambrook等的分子克隆：实验手册(1989)(冷泉巷实验室出版，纽约，美国)的“大肠杆菌中克隆基因的表达”一节里所述的标准杂交条件下互相杂交。这样的条件如在45℃的6.0×ssc中杂交，然后在50℃的2×ssc中进行洗涤的步骤。为了选择严格性，可以例如在用于低严格性的50℃下的2.0×ssc和用于高严格性50℃下的2.0×ssc之间选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，洗涤步骤中温度可在用于低严格性的约22℃的室温和用于高严格性的65℃之间变化。

10、如本文所用，术语“序列同一性”可以用肉眼或计算机软件（比如ausubel et al.eds.（2007）在current protocols in molecular biology中所述的软件程序）进行评价。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列与另一序列具有一定百分比（例如90%、95%、98%或者99%）的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基或氨基酸相同。

11、在第五方面，本发明提供了一种表达盒，包含上述核酸分子。

12、本发明中的表达盒还可以包括增强序列或其他调控元件。

13、在第六方面，本发明提供了一种重组载体，包含上述核酸分子或上述表达盒。

14、本发明中的重组载体包括克隆载体和表达载体，克隆载体用于复制相关序列，表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以为pet28b载体。

15、在第七方面，本发明提供了一种重组细胞，包含上述核酸分子、上述表达盒或上述重组载体。

16、在一些实施方案中，重组细胞的制备方法包括将上述重组载体转化至表达宿主细胞中的步骤。

17、在第八方面，本发明提供了上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：对上述重组细胞进行培养，经诱导表达，得到培养物；从培养物中分离肽聚糖水解酶lysph1或肽聚糖水解酶突变体lysph1-k。

18、本发明中，培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组细胞正常生长即可。并且从培养物中分离出上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k的方法均是本领域的常规方法。

19、在一些实施方案中，上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k的制备方法中所使用的培养基是本领域内可表达蛋白质的培养基，优选lb培养基。

20、在第九方面，本发明提供了上述抗菌肽lysph1-cp、上述肽聚糖水解酶lysph1或上述肽聚糖水解酶突变体lysph1-k在如下任一种中的应用：c1）裂解革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌中的应用；c2）制备抗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染药物中的应用；c3）制备抗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染饲料添加剂中的应用。

21、在一些实施方案中，革兰氏阴性菌包括鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌中的一种或多种；革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、化脓链球菌和肺炎链球菌中的一种或多种。

22、本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明中的抗菌肽lysph1-cp、包含该抗菌肽lysph1-cp的肽聚糖水解酶lysph1或包含该肽聚糖水解酶lysph1的肽聚糖水解酶突变体lysph1-k均具有较好的热稳定性，并且在体外对鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、化脓链球菌和肺炎链球菌具有较好的裂解效果，能广谱裂解革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌；同时该肽聚糖水解酶lysph1、该肽聚糖水解酶突变体lysph1-k能在大肠杆菌中进行可溶性表达，酶活性高。因此，该抗菌肽lysph1-cp、该肽聚糖水解酶lysph1、该肽聚糖水解酶突变体lysph1-k在制备抗感染类药物以及饲料添加剂的研发中具有较好的应用前景。