一锅级联酶反应合成虎杖苷的方法

本发明涉及一种一锅级联酶反应合成虎杖苷的方法，属于生物工程及生物合成。

背景技术：

1、糖苷化对生物体的正常生命活动具有重要意义，它还可以增强天然产物的生物活性与多样性，进而控制生物体的生长和发育。该反应也是自然界中最普遍也是最重要的修饰作用之一。研究表明，糖基化有能力改变苷元的药理作用，并增强其他属性，制药行业越来越多地采用生物催化糖基化技术进行药物研发。

2、糖基转移酶(glycosyltransferase,gt)是一种促进糖苷基从xdp(活性糖苷化合物)转移到其他分子的酶。测序技术已经在不同的微生物基因组中发现了许多糖基转移酶(gts)，根据氨基酸序列、结构和糖苷连锁特征，糖基转移酶(gts)已被划分为117个家族。然而，只有少数gts被研究并表征其独特的糖基化能力和效率。二苯乙烯是几种植物中发现的一类酚类化合物，以其抗氧化和抗炎特性而闻名。二苯乙烯应用上突出例子包括白藜芦醇、桂皮醇和紫檀二苯乙烯。广泛的研究表明，这些物质具有多种健康益处，包括减少炎症、改善心脏健康和预防癌症。

3、白藜芦醇是虎杖苷的苷元，因其抗癌、抗衰老、抗炎等特性而备受关注。有研究探讨了白藜芦醇用于治疗代谢综合征的前景，证明了其对大鼠体重、血压、血糖水平和胰岛素抵抗的影响。然而，由于白藜芦醇水溶性有限，口服吸收不足限制了治疗效果，阻碍了其发挥作用。为了解决这个问题，一种被称为虎杖苷(白藜芦醇糖苷)的化合物已被确定为具有优异的水溶性。与白藜芦醇相比，虎杖苷是一种天然化合物，具有优越的生物利用度和药理特性。虎杖苷对神经系统、心脑血管系统、呼吸系统等均有保护作用，对肝、肾、肺等器官亦作用明显,，其调节血糖血脂的作用对抗动脉粥样硬化效果显著；其抗纤维化的作用对肝、肾保护效果明显。虽然白藜芦醇和虎杖苷具有相同的抗氧化活性，但虎杖苷在清除自由基方面更有效。此外，与白藜芦醇相比，虎杖苷对乙型肝炎病毒的抗病毒作用更强，虎杖苷还能有效缓解顺铂的毒副作用。

4、现有的生产虎杖苷的方法主要是利用微生物宿主如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)体内生物合成，此方法产率较低。这是由于ugt(udp-葡萄糖转移酶)的催化能力、酵母细胞的合成能力以及合成的虎杖苷的抑制作用的限制。此外，用化学方法将虎杖苷化以生产多聚糖会遇到立体特异性不足、不良副反应、效率不理想和环境污染等困难。所以，目前亟需一种高效合成虎杖苷的方法，以解决化学反应副产物污染环境、及利用ugt导致机制作用等技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些问题，本发明提供一锅级联酶反应合成虎杖苷的方法，本发明以价值化为方向，构建高效混交糖基转移酶，提供一种利用廉价的蔗糖与白藜芦醇生物合成多聚糖并生产虎杖苷的方法。

2、为实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一锅级联酶反应合成虎杖苷的方法，所述的方法包括如下步骤：

4、将白藜芦醇、蔗糖、udp混合，加入tris-hcl缓冲液，将反应体系在搅拌状态下反应一段时间，反应过程中通过分批间歇补料的方式加入糖基转移酶、蔗糖合成酶以及白藜芦醇，得到虎杖苷；其中所述白藜芦醇的添加方式为将白藜芦醇溶解在dmso中，间歇补料添加。

5、进一步的，所述糖基转移酶为ugt109a3，氨基酸序列如seq id no:1所示；所述蔗糖合成酶为gmsus，氨基酸序列如seq id no:2所示。

6、进一步的，所述反应体系中中，白藜芦醇的浓度为0.5-2mm，所述蔗糖的浓度为50-500mm，所述udp的浓度为0.25-5mm，所述dmso的浓度为0-20％，

7、进一步优选的，所述反应体系中，白藜芦醇的浓度为1.0mm，所述蔗糖的浓度为400mm，所述udp的浓度为2.5mm，所述dmso的浓度为10％。

8、进一步的，所述tris-hcl缓冲液浓度为50mm，ph值为8.0。

9、进一步的，所述反应体系的ph为5.0-9.0；所述反应为搅拌条件下，反应温度为30-70℃。

10、进一步优选的，所述反应体系的ph值为8.0；所述反应的温度为40℃。

11、进一步的，所述白藜芦醇间歇补料为每间隔3-48h添加一次，优选的，在0、3、6、12、18、24、30、36、42和48小时时分别加入白藜芦醇。

12、进一步的，所述反应过程中分别在0、12和24小时时补充加入ugt109a3酶和gmsus酶。

13、进一步优选的，所述gmsus酶和ugt109a3酶的酶活分别为50mu-350mu、25mu-200mu；优选为200mu/ml、150mu/ml。

14、根据本发明的实施例，本发明首先构建了糖基转移酶ugt109a3(核苷酸序列如seqid no.1所示)与大豆蔗糖合成酶(gmsus)(核苷酸序列如seq id no.2所示)。在构建了两种酶基因后，本发明通过实验探究了两种酶在大肠杆菌中表达的区域选择性和特异性，蔗糖合成酶(gmsus)可以将蔗糖和udp转化为udp-葡萄糖，并产生果糖；ugt109a3可以将一个葡萄糖基独家转移到白藜芦醇的未结合的c-3羟基上，从而产生虎杖苷。

15、本发明通过实验验证，利用单一的蔗糖合成酶(gmsus)催化蔗糖虽然可以获得udp-葡萄糖，但是由于没有不断地提供供体udp，导致udp-葡萄糖产量低。于是本发明构建了糖基转移酶ugt109a3与蔗糖合成酶(gmsus)偶联一锅级联反应，开发并增强了两种酶偶联的人工生物催化级联，在高效合成虎杖苷的同时连续再生udp-葡萄糖。

16、本发明的有益效果：

17、本发明提供的一锅级联反应方法是目前最高效且最具备价值化生产虎杖苷的一种合成策略，本发明利用糖基转移酶和蔗糖合酶偶联的级联反应既可以很好地解决化学反应副产物环境污染等问题，又可以解决以往生物合成中利用ugt109a3导致抑制作用这一自限制，成为高效合成虎杖苷的理想选择。

18、在等量原料的反应条件下，本发明的偶联一锅级联反应与单一酶催化反应相比，得到的udp-葡萄糖与虎杖苷的产率有明显的提高。ugt109a3与gmsus的结合为天然化合物的糖基化提供了一种有吸引力的方法，因为它能够减少udp-葡萄糖的使用并减轻udp的抑制作用。

19、另一方面，本发明优化了ugt109a3-gmsus生物催化级联的反应条件，在标准反应条件下，分析纯化后的gmsus和ugt109a3不同活性比对级联反应的影响。测定了不同ph值、温度、dmso、udp、蔗糖和白藜芦醇对白藜芦醇糖基化反应的转化率。

20、本发明进一步采用了间歇补料技术，并通过调节ugt109a3与gmsus的酶比成功获得高白藜芦醇转化为虎杖苷的关键参数，实现了高效生产虎杖苷和udp-葡萄糖。

技术特征：

1.一锅级联酶反应合成虎杖苷的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶为ugt109a3，氨基酸序列如seq id no:1所示；所述蔗糖合成酶为gmsus，氨基酸序列如seq id no:2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，白藜芦醇的浓度为0.5-2mm，所述蔗糖的浓度为50-500mm，所述udp的浓度为0.25-5mm，所述dmso的浓度为0-20％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，白藜芦醇的浓度为1.0mm，所述蔗糖的浓度为400mm，所述udp的浓度为2.5mm，所述dmso的浓度为10％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系的ph为5.0-9.0；所述反应为搅拌条件下，反应温度为30-70℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反应体系的ph值为8.0；所述反应的温度为40℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白藜芦醇间歇补料为每间隔3-48h添加一次。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述白藜芦醇在0、3、6、12、18、24、30、36、42和48小时时分别加入。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应过程中分别在0、12和24小时时加入ugt109a3酶和gmsus酶，所述gmsus酶和ugt109a3酶的酶活分别为50mu-350mu、25mu-200mu。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述gmsus酶和ugt109a3酶的酶活分别为200mu/ml、150mu/ml。

技术总结本发明涉及一锅级联酶反应合成虎杖苷的方法，属于生物工程及生物合成技术领域。本发明首先构建表达糖基转移酶UGT109A3与大豆蔗糖合成酶GmSUS的表达载体，然后转化大肠杆菌表达得到糖基转移酶和大豆蔗糖合成酶；然后以白藜芦醇为底物和蔗糖为原料，在酶的催化下合成虎杖苷。本发明的方法利用糖基转移酶和蔗糖合酶偶联的级联反应，一锅反应合成虎杖苷，既可以很好地解决化学反应副产物环境污染等问题，又可以解决以往生物合成中利用UGT导致抑制作用这一自限制，达到高效合成虎杖苷的目的。技术研发人员：朱道辰,张正昊,高嘉悦受保护的技术使用者：江苏大学技术研发日：技术公布日：2024/9/9