检测五种血小板抗体的试剂盒及制备方法、使用方法和应用与流程

本发明涉及生物检测，具体涉及一种检测五种血小板抗体的试剂盒及制备方法、使用方法和应用。

背景技术：

1、自身免疫性血小板减少症是一类由自身抗体导致血小板破坏增多的出血性疾病，自身免疫性血小板减少症的英文简称为itp。多数学者认为自身免疫性血小板减少症与体液免疫有关，机体对血小板相关蛋白发生免疫反应，产生抗血小板抗体，大量的抗血小板抗体活跃于脾脏中，血小板会通过脾脏以高度的选择性与抗血小板抗体发生结合，不仅会使人们出现各种过敏反应，而且结合完成后还会被单核巨噬细胞完全吞噬掉，此时血小板的含量发生骤降，患有自身免疫性血小板减少症的患者的骨髓巨核细胞有成熟障碍。在排除其他继发性血小板减少症的基础上，目前itp的诊断仍依赖临床表现和骨髓检查。检测血小板抗体虽然已成为itp实验室诊断的一个重要指标，但是市面上制备得到的检测血小板抗体的试剂盒由于检测抗体为多克隆抗体且试剂盒操作步骤繁琐的缘故，导致试剂盒在使用过程中需要的检测时间长且检测操作复杂；同时有些试剂盒中的检测抗体为单克隆抗体，然而单克隆抗体直接与生物素连接进行检测，检测过程中单克隆抗体与生物素之间的空间位阻的影响较大，从而对检测结果造成不良的影响，以上原因导致现有试剂盒存在检测效率低和准确度低的缺点。

2、因此，急需提供一种新的可同时检测多种血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法以解决现有技术存在的上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测五种血小板抗体的试剂盒及制备方法、使用方法和应用，通过优化抗人igg抗体的序列，增强抗人igg抗体和血小板抗体间的结合力，从而显著提高试剂盒检测结果的准确性与灵敏度，并显著降低了抗人igg抗体的用量；通过在抗人igg抗体溶液中添加封闭剂(包括bsa、甘氨酸、明胶水解物、peg、ce210)，显著降低了样本中其余抗体(非血小板抗体)和抗人igg抗体之间的结合，也解决了抗人igg抗体标记pe所导致的血小板抗体和抗人igg抗体在结合过程中受到pe荧光空间位阻的干扰，进一步减小了空间位阻，同时显著提高了抗人igg抗体与血小板抗体的有效结合，进一步提高了检测结果的灵敏度、准确性与特异性；通过添加捕获抗体微球混合液，可一次性检测五种特异性抗体，显著提高试剂盒的检测效率和准确度，同时降低检测时间、降低试剂和人工的成本；同时还改进了血小板裂解液、血小板反应缓冲液的配方，进一步提高了试剂盒检测的准确度和灵敏度，同时具有较好的重复性和批间差，使批内实验的变异系数不大于5％，批间实验的变异系数不大于8％。

2、一方面，本发明提供一种基于流式细胞仪同时检测五种血小板抗体的试剂盒，包括捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、血小板洗涤液、洗涤缓冲液、血小板反应缓冲液；所述检测抗体溶液中，包括抗人igg抗体，所述抗人igg抗体的重链的氨基酸序列如seq id no.6所示，轻链的氨基酸序列如seq id no.8所示；

3、进一步地，所述编码抗人igg抗体的重链的核苷酸序列如seq id no.5所示，轻链的核苷酸序列如seq id no.7所示。

4、在最初制备本发明可同时检测五种血小板抗体的试剂盒的过程中，使用市售的抗人igg抗体(厂家：bio-rad，货号：mca647g)，发现对于市售抗人igg抗体的用量需求极大，但是依然存在检测灵敏度低的问题，因此发明人想到了通过优化抗人igg抗体的序列来解决这一问题。在一些实施方式中，通过对抗人igg抗体h/l链的cdr3区序列分别设计核苷酸突变，最终得到16种抗人igg抗体的序列。为测试16组序列制备得到的igg抗体的效果，分别取市售的抗人igg抗体、以及所述16组序列制备得到的igg抗体制备试剂盒，进行同步检测。实验结果表明：对于本发明中五种血小板抗体，选择不同抗人igg抗体制备试剂盒，对检测结果的准确性与灵敏度均具有极大影响。当优选组合14的序列制备抗人igg抗体，此时试剂盒对五种血小板抗体检测结果的准确度与灵敏度均显著提升。其中，所述组合14最终优化后制得抗人igg抗体(h-1/l-3)。

5、进一步地，所述捕获抗体微球混合液中的捕获抗体包括五种血小板抗体；所述五种血小板抗体包括抗人gpⅸ特异性抗体、抗人gpⅰb特异性抗体、抗人gpⅱb特异性抗体、抗人gpⅲa特异性抗体和抗人gmp140特异性抗体中的任意一种或多种的组合。

6、进一步地，所述检测抗体溶液中还包括封闭剂，所述封闭剂包括bsa、甘氨酸、明胶水解物、peg、ce210中的任意一种或多种的组合。

7、在一些实施方式中，对加入封闭剂对五种血小板抗体检测结果的影响进行探究，实验结果表明：在制备检测抗体溶液时，需先向所述抗人igg抗体溶液中加入合适工作浓度的封闭剂后，再加入生物素进行标记处理，封闭剂的加入对优化后的igg抗体序列的结合位点进行封闭，显著降低了样本中其余抗体(非血小板抗体)和抗人igg抗体之间的结合，也解决了抗人igg抗体标记pe所导致的血小板抗体和抗人igg抗体在结合过程中受到pe荧光空间位阻的干扰，从而进一步显著降低空间位阻，同时也显著提高了抗人igg抗体与血小板抗体的有效结合，使参与有效反应的抗人igg抗体明显增加，信号值上升，才使得最终制得可同时高灵敏度检测五种血小板抗体的试剂盒，且检测结果准确性、灵敏度与特异性均显著提高。

8、同时，也对不同封闭剂对五种血小板抗体检测结果的影响进行了对比测试，实验结果表明：只有当优选加入封闭剂1：bsa、甘氨酸、明胶水解物、peg、ce210时，才可显著降低抗人igg抗体与样本中其余非特异性抗体的结合，从而提高检测结果的准确性与特异性。

9、进一步地，所述血小板裂解液包括tris、nacl、四甲基氯化铵、triton x-100、sds中的任意一种或多种的组合。

10、在一些实施方式中，对血小板裂解液的配方对试剂盒检测结果的影响进行了探究，实验结果表明：只有当选择中最佳血小板裂解液1的配方时，样本的检测结果才可达到完全准确，且平均荧光强度显著高于临界值；而当替换血小板裂解液配方成分时，检测结果均会产生明显降低，从而显著降低检测的准确性与灵敏度。

11、进一步地，所述血小板反应缓冲液包括tris、nacl、n-月桂酰肌氨酸钠盐、bsa、krovin500、tween-20中的任意一种或多种的组合。

12、在一些实施方式中，对血小板反应缓冲液的配方对试剂盒检测结果的影响进行了探究，实验结果表明：只有当选择最佳血小板反应缓冲液1的配方时，样本的检测结果才可达到完全准确，且平均荧光强度显著高于临界值；而当改变血小板反应缓冲液配方成分时，检测结果均会产生明显降低，从而显著降低检测的准确性与灵敏度。

13、进一步地，所述检测抗体溶液中的抗人igg抗体，采用生物素标记；所述抗人igg抗体与所述生物素的摩尔比为1:(5～20)。

14、进一步地，所述生物素为琥珀酰亚胺-6-(生物素酰氨基)-6-己酰氨基己酸酯。

15、进一步地，所述偶联物溶液包括荧光素标记的链霉亲和素，每毫升所述偶联物溶液含有1-5微克荧光素标记的链霉亲和素。

16、进一步地，所述荧光素包括藻红蛋白、别藻蓝蛋白、紫草素叶绿素、异硫氰酸荧光素中的任意一种或多种的组合。

17、另一方面，本发明提供一种如上技术方案中任一项所述的试剂盒的制备方法，所述检测抗体溶液的制备中，先将封闭剂加入抗人igg抗体溶液中进行封闭处理，混合均匀后，再加入生物素进行标记处理。

18、再一方面，本发明提供一种抗人igg抗体用于制备提高试剂盒同时检测五种血小板抗体的检测准确性与灵敏度的制剂的用途，所述抗人igg抗体的重链的氨基酸序列如seqid no.6所示，轻链的氨基酸序列如seq id no.8所示；所述编码抗人igg抗体的重链的核苷酸序列如seq id no.5所示，轻链的核苷酸序列如seq id no.7所示。

19、再一方面，本发明提供一种封闭剂用于制备降低抗人igg抗体与生物素之间的空间位阻的制剂的用途，所述封闭剂包括bsa、甘氨酸、明胶水解物、peg、ce210中的任意一种或多种的组合。

20、再一方面，本发明提供一种封闭剂用于制备提高试剂盒同时检测五种血小板抗体的检测准确性与灵敏度的制剂的用途，所述封闭剂包括bsa、甘氨酸、明胶水解物、peg、ce210中的任意一种或多种的组合。

21、再一方面，本发明提供一种血小板裂解液用于制备提高同时检测五种血小板抗体的检测的准确性与灵敏度的制剂的用途。

22、再一方面，本发明提供一种血小板反应缓冲液用于制备提高同时检测五种血小板抗体的检测的准确性与灵敏度的制剂的用途。

23、再一方面，本发明提供一种用于同时检测五种血小板抗体的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

24、s0：提供血小板、捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品；

25、s1：使用所述血小板裂解液对所述血小板进行裂解，离心取上清液以得到待检样本；

26、s2：分别向每管中加入捕获抗体微球混合液、样本、检测抗体溶液、偶联物溶液，充分混合均匀，室温避光静置2.5h(一步孵育)；

27、s3：加入1000μl的1×洗涤缓冲液，进行涡旋重悬，以得到待检测物(一次洗涤)；

28、s4：检测所述待检测物的荧光类型和荧光强度，以得到所述待检测物中是否含有血小板抗体。

29、本发明的一些实施例，所述制得的试剂盒，使用方法简单，且仅需一步孵育、一次洗涤，即可使试剂盒检测结果的准确性和灵敏度均得到显著提高。

30、本发明取得的有益效果：

31、1、本发明提供的一种试剂盒，通过优化抗人igg抗体的序列，显著增强抗人igg抗体和血小板抗体间的结合力，从而显著提高试剂盒检测结果的准确性与灵敏度，同时还显著降低了抗人igg抗体的用量，降低实验成本。

32、2、本发明提供的一种试剂盒，通过先在抗人igg抗体溶液中加入封闭剂，再加入生物素进行标记处理，在生物素引入放大系统的基础上，封闭剂的加入显著降低了样本中其余抗体(非血小板抗体)和抗人igg抗体之间的结合，也解决了抗人igg抗体标记pe所导致的血小板抗体和抗人igg抗体在结合过程中受到pe荧光空间位阻的干扰，进一步减小了空间位阻，同时显著提高了抗人igg抗体与血小板抗体的有效结合，使参与有效反应的抗人igg抗体明显增加，信号值上升，从而进一步提高了检测结果的灵敏度、准确性与特异性。

33、3、本发明提供的一种试剂盒，通过添加捕获抗体微球混合液，可一次性检测五种特异性抗体，显著提高试剂盒的检测效率和准确度，同时降低检测时间、降低试剂和人工的成本，解决了现有制备方法制备得到的试剂盒检测效率低和准确度低的问题。

34、4、本发明提供的一种试剂盒，通过改进了血小板裂解液和血小板反应缓冲液的配方，显著提高检测结果的准确性、灵敏度与特异性。

35、5、本发明制得的试剂盒，使用方法简单，且仅需一步孵育、一次洗涤，即可使试剂盒检测结果的准确性和灵敏度均得到显著提高，且当样本中五种血小板抗体含量为10μg/ml时，仍可检出，且阳性率为100％；同时具有结果较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数不大于5％，批间实验的变异系数不大于8％。