一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法与流程

本发明涉及微生物计数，具体为一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法。

背景技术：

1、生物制药、益生菌培养和啤酒、果酒、酸奶以及酱香型白酒的酿造过程实际上是在发酵罐中培养和富集微生物的过程。因此，要提高生物药和酒类的优质品率，必须从微生物开始进行研究，而微生物计数一直是酿酒微生物研究中一个重要基础指标，啤酒和果酒中的微生物酵母菌。

2、目前，酿酒微生物计数主要采用平板菌落计数法，因平板菌落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大，重复性、平行性好，是一种经典的计数方法。但是，平板菌落计数的前提是在提取发酵母液后，采用琼脂培养基倾注法接种，对其进行3～4天的细菌培养，再对平板菌落进行人工计数或用菌落计数器进行自动计数。这些方法工作量大、重现性差、计数周期长、效率低，只能在最后一步可以采用菌落计数器自动统计，无法满足酿酒过程中，快速甚至在线进行发酵液微生物计数的要求。

3、其它现有的微生物计数方法也无法避免细菌培养和样品处理的周期过程，它具体包括：

4、1.荧光显微镜计数法：对培养后的细菌进行染色标记，再进行检测；

5、2.分子生物学计数法：通过pcr技术对细菌进行扩增并荧光标记，再进行计数，这种方法适用于水体中微量细菌的特异性检出，下限低，但不适用于发酵液中上亿微生物检出；

6、3.酶联免疫吸附法(elisa法)：该方法是通过固相载体吸附抗体(抗原)，然后加入待测抗原(抗体)，再与相应酶标抗体(抗原)反应，最终生成抗体(抗原)-待测抗原(抗体)-酶标抗体(抗原)复合物，向复合物中加入酶的底物后，通过反应生成的有色物质对待测样品进行定性或定量分析；

7、4.光学生物传感器法：这种方法往往需要与pcr或eli sa联用；

8、5.微生物代谢法：包括三磷酸腺苷(atp)生物发光法、电阻抗法、等温微量热法和greenl ighttm系统计数法，这些方法都是在细胞培养中测定细胞某一参数的变化(如atp发光强度、培养基阻抗变化、细胞放热曲线或耗氧量)进行定量分析，测试过程在20小时以上；

9、6.流式细胞仪(fcm)计数法：该方法广泛应用于食品微生物的检验中，但通常情况下，需要使用荧光染料标记细菌，不适合高浓度细菌的应用场景；

10、7.微流控系统(microf l u id ics)计数法：利用微流控系统将荧光标记的大肠杆菌包裹成液滴，分散到体积为2nl的1495个独立小室中，结合泊松理论分析液滴中细菌的数量。该方法的相对误差小于20％，测定的细菌浓度范围在7×104～3×106个细菌/ml之间，检测过程在10～20h内完成，此方法需要太多的独立小室，进样时间较长；

11、8.质谱(icp-ms)计数法：利用具有光学特性的等离子体金纳米颗粒与沙门氏菌dt104的单克隆抗体(mab)偶联，通过电感耦合等离子体质谱(icp-ms)测定金粒子的浓度，当细菌浓度在102～105cfu/ml之间，金粒子的浓度与样品中细菌总数呈线性关系，相关系数r2＝0.99，该方法在40min内完成测定，检测限为100cfu/ml，如果样品中细菌浓度大于105cfu/ml，细菌会发生聚集，该方法测定的数据将不准确；

12、9.荧光计数法：系统自动计数具有荧光的菌落个数，或通过光纤光谱仪系统记录染料标记的细菌的发射光谱，运用三种回归模型分析样品中的细菌浓度；

13、10.mi crosnaptm计数法：基于atp生物发光法，通过测定细菌胞质内atp总浓度来定量细菌总数；

14、11.simp l atetm计数法：是在培养基中加入许多食源性微生物共同具有的几种酶的底物，底物被酶分解后释放的4-甲基伞菌酮(4-methy l umb i l l iferone)在365nm紫外光激发下产生蓝色荧光，利用激发出的荧光测定水样品中的细菌总数；

15、12.系统计数法：是测定样品中细菌总数的自动化设备，细菌生长时产生的代谢产物与系统提供的培养基发生反应，产生荧光信号，系统识别具有荧光的细菌，计数样品中细菌总数。

16、综上所述，当前所有微生物计数方法都需要对样品进行长时间处理(细菌培养，荧光标记或染色，或加入酶标物或纳米金等)，不能满足对发酵液中的发酵微生物含量“即取即测”的迫切需要。

17、因此，本领域技术人员提供了一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法，解决了当前所有微生物计数方法都需要对样品进行长时间处理，如细菌培养，荧光标记或染色，或加入酶标物或纳米金等，不能满足对发酵液中的发酵微生物含量“即取即测”的迫切需要的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

5、一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法，其利用图像采集、识别、提取和分类的手段直接对发酵微生物母液进行酵母菌计数，包括以下步骤：

6、步骤s1.采集发酵液，并定量稀释100～1000倍，调节菌体浓度以保持其分散不粘连，配置得到待测菌类的样品溶液；

7、步骤s2.将样品溶液通过计量泵输送进可定体积的湿法样品池，并调节流速，通过管路和样品池厚度差异产生的湍流控制样品中颗粒的最大面冲向镜头；

8、步骤s3.通过控制器调节相机镜头，使样品池中流过的液体通道全部在采样范围内，采样体积深度在相机的景深范围内，开始拍摄和数据采集；

9、步骤s4.控制器通过自适应算法选择二值化的阈值，然后对包含菌体颗粒的图像进行二值化识别，得到二值化的颗粒图像；

10、步骤s5.控制器对菌体的颗粒图像进行轮廓确定，并提取图像中所有的颗粒投影和轮廓信息，并计算出每个颗粒的大小和形状参数并计数；

11、步骤s6.控制器对所有采集的图像均重复步骤s4～s5，直至达到设定的图像采集数或颗粒数，即可完成累积计数；

12、步骤s7.根据酵母菌的粒度和形状参数，滤除其它杂质或杂菌颗粒，并根据测定终止时流过的液体体积量，计算出酵母菌的数量。

13、进一步地，在执行所述步骤s2时，控制器控制调节样品溶液流过样品池的速度与所选的相机的帧率匹配，以保证颗粒拍摄清晰。

14、进一步地，在执行所述步骤s3前，控制器控制调整菌体颗粒图像的灰度范围，增强被测颗粒图像的对比度，减少样品体系中其它颗粒对被测颗粒的干扰。

15、进一步地，在执行所述步骤s5时，控制器识别出图像中的菌体颗粒之后，除计数之外，识别出每个颗粒的长度、宽度、周长、面积、圆度、凸度、凹度等粒度和粒形信息，以便后续进行更多数据处理。

16、进一步地，在执行所述步骤s6时，控制器识别出图像中的菌体颗粒之后，对图像中的所有菌体颗粒进行计数。

17、进一步地，利用显微图像法对发酵液中酵母菌的快速计数检测方法，无需细菌培养过程，从提取发酵液到完成其中的酵母菌计数可在一小时内完成，且其所使用的装置包括计量泵、具有体积定量功能的湿法样品池、具有显微放大功能的成像系统，以及带有统计功能的图像处理算法。

18、进一步地，所述湿法样品池包括样品池及光学窗片区域，本方法采用具有固定厚度和固定宽度的垫片，保证颗粒均从光学检测器焦距通过，从而可以准确定量颗粒数目，实现绝对计数(颗粒数)和相对计数(颗粒数/毫升)，所使用到的计算公式如下：

19、采样率＝分析体积/泵送体积

20、分析体积＝图像面积x样品池厚度

21、图像面积＝像素数x2

22、其中，样品池厚度即垫片厚度。

23、(三)有益效果

24、本发明提供了一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法。具备以下有益效果：

25、1、本发明提供了一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法，将图像处理方法和显微成像技术相结合，将发酵母液仅需按比例简单稀释，就能通过对酵母菌的大小和形状进行识别、提取单体图像，并对其单位体积中的数目进行快速定量统计，克服了现有微生物计数方法的局限性，无需细菌培养、染色或标记，在一定条件下实现了对微生物样品的快速绝对计数和相对计数工作。

26、2、本发明提供了一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法，省却了细菌培养、荧光标记或染色过程，从发酵液直接取样到出结果从几天缩短到1小时以内，更加快速，由仪器自动统计计数，避免了人工显微镜下计数统计，节约了人力成本和时间成本。

27、3、本发明提供了一种发酵微生物酵母菌的快速计数检测方法，能够直接反映发酵母液中的微生物浓度，单位个/ml，而不是菌落数cfu/ml，能根据需要，显示任何一个被统计微生物颗粒的二值化图像，能根据酵母菌的粒度和形状特点，将其它颗粒过滤，仅统计酵母菌，统计结果更加准确可靠。