一种铂-碳氮人工生物催化剂、活性氧清除水凝胶的制备方法及其产品和应用

本发明涉及了口腔医学材料领域，具体涉及了一种铂-碳氮人工生物催化剂、活性氧清除水凝胶的制备方法及其产品和应用。

背景技术：

1、人的一生仅有乳牙和恒牙两副牙齿，乳牙6岁时陆续被恒牙替换，然而恒牙一旦缺失就不会再长出新的牙齿，因此保护好牙齿非常重要。随着饮食结构不断丰富，娱乐活动越来越多样，年轻恒牙牙髓炎和根尖周炎等疾病高发，导致牙根发育停滞，根尖孔粗大，牙根吸收甚至牙齿脱落。传统治疗方式包括活髓切断术和根尖诱导成形术，但是对年龄稍大的患者成功率并不高，且磨牙手术操作难度大，成功率相对低，最终只能根管治疗。而根管治疗是将炎症牙髓杀死去除，然后预备和消毒根管，最后严密充填。然而这种方式只能保存牙体组织，无法促进牙根继续发育和根尖孔闭合，同时缺乏牙髓营养的牙齿会出现变色和折裂等问题。因此，如何实现受损牙髓的生物性修复和功能再生，促进牙齿继续发育是我们追求的目标。

2、再生牙髓是根管治疗的一种新理念，是运用组织再生技术修复牙髓，恢复牙髓功能，促进牙齿发育和功能恢复。再生牙髓的主要方法是将从乳牙和恒牙中分离出的人牙髓干细胞作为种子细胞移植进根管，利用干细胞的多向分化潜能实现牙髓再生。目前许多研究将牙髓干细胞接种于支架材料后植入根管促进牙髓再生，但是由于牙髓腔和根管特殊的解剖结构，植入后常出现急性缺氧，产生大量超氧阴离子等活性氧损伤牙髓干细胞，导致移植失败。

3、生物体清除活性氧主要依赖超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，但是在急性缺氧等异常生理状态下，难以凭借机体自身及时清除大量产生的活性氧。现有技术中研究发现，氧化铈等纳米粒子虽然也具有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性，但是只有当氧化铈粒径小于5nm时，才具有较好的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶模拟活性，过小苛刻的粒径要求不仅合成困难，而且具有较大的生物毒性。

4、因此，研究出一种合成方法简单、生物毒性小，且活性氧清除效果好的用于再生牙髓移植的材料具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对现有技术缺少存在的一种合成方法简单、生物毒性小，且活性氧清除效果好的用于再生牙髓移植的材料，提供一种铂-碳氮人工生物催化剂、活性氧清除水凝胶的制备方法及其产品和应用。该催化剂将铂簇配备在氮化碳框架上，铂具有更多的d电子，有利于催化过程中化学键形成，以及更多的未占据d轨道在催化过程中接受电子，表现出更高的形成配位配合物的倾向。pt-n配位的活性中心有效地接受和传递电子，具有更出色的催化清除活性氧特性，能够高效消除干细胞移植后急性缺氧产生的活性氧并改善缺氧环境。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种铂-碳氮人工生物催化剂的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤1、将三聚氰胺缓慢升温至550℃以下，保持2-3h，然后，冷却至室温，洗涤、干燥处理，得到氮化碳；

5、步骤2、取步骤1得到的氮化碳加入次氯酸钠水溶液中，搅拌4-6天氧化剥离，过滤，洗涤；

6、步骤3、将步骤2得到的滤饼加入水中进行连续超声90min以上，静置，取上层液体，离心，收集上层溶液，冷冻干燥，得到相对均匀的小片层氮化碳；

7、步骤4、取步骤3得到的材料加入水中，超声处理；然后在油浴条件下，滴入六水合氯铂酸，搅拌4-6h；

8、步骤5、将步骤4得到的样品进行过滤、洗涤，干燥处理，得到铂-碳氮人工生物催化剂；铂-碳氮人工生物催化剂中含铂量为2.5wt％-5wt％。

9、本发明提供了一种铂-碳氮人工生物催化剂的制备方法，首先将三聚氰胺进行高温处理得到氮化碳，然后利用次氯酸钠水溶液氧化剥离，之后将滤饼溶解在水中进行连续超声，沉淀收集上层液体，上层液体离心取溶液相冷冻干燥；将冷冻干燥后的材料加入水中，在油浴条件下滴入六水合氯铂酸，搅拌反应，制备得到铂-碳氮人工生物催化剂，通过控制制备条件以及铂的添加量，使得该催化剂不仅具有较低的毒性，同时发挥有效的催化效果。该催化剂将铂簇配备在氮化碳框架上，铂具有更多的d电子，有利于催化过程中化学键形成，以及更多的未占据d轨道在催化过程中接受电子，表现出更高的形成配位配合物的倾向。pt-n配位的活性中心有效地接受和传递电子，具有更出色的催化清除活性氧特性，能够高效消除干细胞移植后急性缺氧产生的活性氧并改善缺氧环境。

10、进一步的，所述步骤1中，将三聚氰胺缓慢升温至500℃～550℃。研究发现，升温速率不宜过快，温度不宜超过550℃，否则都会导致氮化碳产率降低且引入杂质。

11、更进一步的，所述步骤1中，三聚氰胺以1℃/min～5℃/min的升温速率加热至500℃～550℃。

12、进一步的，所述步骤2中，次氯酸钠水溶液中，每10ml的水中加入1.5-3ml次氯酸钠。

13、进一步的，所述步骤3中，滤饼加入水中进行连续超声90～120min。连续超声90分钟以上，且沉淀后取上层液体离心后收集溶液相干燥，能够保证获得比较均一且片层较小的氮化碳。

14、进一步的，所述步骤4中，油浴的温度为60℃～80℃。

15、进一步的，所述步骤5中，得到的铂-碳氮人工生物催化剂中含铂量为3wt％-4.5wt％。研究发现，2.5wt％-5wt％铂含量的人工催化剂具有较好的活性氧清除效果和生物安全性。3wt％-4.5wt％的含铂量可表现出更好的活性氧清除效果。

16、本发明的另一目的是为了保护上述方法制备的产品。

17、如上述的铂-碳氮人工生物催化剂的制备方法制备得到的催化剂产品。

18、以铂作为活性中心，合适的比例不仅能够降低材料的毒性，同时发挥有效的催化效果。2.5wt％-5wt％铂含量的人工催化剂具有较好的活性氧清除效果和生物安全性，取得了意想不到的技术效果。

19、一种活性氧清除水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

20、s1、将丙烯酰化β-环糊精加入pbs中，得到第一物料，所述第一物料中丙烯酰化β-环糊精的质量浓度为10％～20％；

21、s2、将明胶溶解在第一物料中，得到第二物料；第二物料中明胶的质量浓度为8％～15％；

22、s3、向所述第二物料中加入lap，得到第三物料；第三物料中lap的质量浓度为0.1％～0.3％；

23、s4、将如权利要求7所述的催化剂产品加入所述第三物料中，得到第四物料；所述第四物料中所述催化剂产品的质量浓度为0.04％～0.06％；

24、s5、采用紫外灯照射，将所述第四物料进行交联反应，得到活性氧清除水凝胶。

25、本技术提供的活性氧清除水凝胶，将丙烯酰化β-环糊精、pbs、明胶、lap以及铂-碳氮人工生物催化剂进行混合，通过控制各个原料的添加量以保证水凝胶良好的稳定性；然后通过紫外光照射进行交联反应，得到活性氧清除水凝胶。具体的，丙烯酰化β-环糊精，可以与明胶通过主客体组装形成水凝胶(acd)作为细胞支架，由于主客体组装特性，细胞可黏附并且在水凝胶中迁移分化生长。将合成的人工生物催化剂加载在主客体组装水凝胶中(pacd)，不仅利于酶模拟活性稳定性，降低生物毒性，而且利于细胞迁移生长，为牙髓再生开辟了新的路径。同时，本技术采用化学物理交联组合的方法，紫外光激发丙烯酰化β-环糊精双键化学交联，丙烯酰化β-环糊精中的空腔和明胶分子中的芳香族残基发生弱主客体物理交联，紫外化学交联(较大作用力)提供凝胶支架稳定性和可注射性，主客体物理交联(较小作用力)利于细胞黏附迁移。使得制备的水凝胶既能改善急性缺氧微环境，清除活性氧，且促进细胞黏附迁移生长且符合临床干细胞移植需求，便于推广应用。

26、水凝胶是一类具有三维网络结构的聚合物，具有含水量高，生物相容性好，结构和机械性能可调等优势，广泛应用在组织工程支架，药物递送载体和柔性传感等领域。来源于动物皮或骨的明胶是胶原部分水解后得到的一类蛋白质，对明胶改性可以得到能够在在紫外或可见光作用下化学交联的水凝胶，具有适于细胞生长的特性和降解性。但是通过化学键交联形成的水凝胶，细胞难以突破化学作用在凝胶中迁移生长。

27、水凝胶是一类常见的组织工程支架，但是gelma等大多数水凝胶都是通过化学交联形成凝胶，细胞突破化学键力黏附迁移是比较困难的，于是将目标放在了物理交联。β-环糊精分子中含有空腔，可以和明胶分子中的芳香族残基发生弱主客体物理交联，但是仅靠弱主客体交联作用难以形成稳定的凝胶支架，于是对β-环糊精进行丙烯酰化，再通过紫外光化学交联形成稳定凝胶支架。紫外化学交联不仅使水凝胶能在口腔狭小根管中注射成胶，同时提高了水凝胶支架的稳定性；主客体物理交联使凝胶更适于牙髓干细胞黏附和迁移，更利于牙髓组织再生。

28、进一步的，所述s1中，pbs是磷酸盐缓冲液(ph7.4)。

29、进一步的，明胶的类型可以是明胶(a)型、明胶(b)型。

30、进一步的，lap是苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂。

31、进一步的，铂-碳氮人工催化剂质量浓度为0.04％～0.06％，浓度过小不能有效清除活性氧，浓度过大影响生物安全性。

32、进一步的，s5中，10mw/cm2的紫外灯照射5-10min。

33、进一步的，s1中，丙烯酰化β-环糊精采用以下方法制备得到的，

34、i、将β-环糊精添加到n,n-二甲基甲酰胺中，取三乙胺添加到溶液中，置入冰水浴中搅拌；

35、ii、取丙烯酰氯缓慢添加到步骤i得到的溶液中，搅拌后过滤；

36、iii、收集步骤ii产生的滤液加入过量的丙酮并过滤洗涤，真空干燥得到丙烯酰化β-环糊精。

37、进一步的，每10gβ-环糊精，配比120-200mln,n-二甲基甲酰胺、3-4ml三乙胺以及2.2-3ml丙烯酰氯。

38、如上述的活性氧清除水凝胶的制备方法制备得到的活性氧清除水凝胶。

39、改善急性缺氧微环境，清除活性氧，促进细胞黏附迁移生长且符合临床干细胞移植需求的水凝胶，便于推广应用。

40、如上述的活性氧清除水凝胶在移植再生牙髓中的应用。

41、本技术提供的活性氧清除水凝胶能够有效改善根管牙髓干细胞(dpscs)移植后的急性缺氧环境，特别是其活性氧清除特性，很大程度上避免了缺氧产生的活性氧危害，大大提高牙髓干细胞移植成活率，便于推广应用。

42、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

43、1、本发明提供了一种铂-碳氮人工生物催化剂的制备方法，首先将三聚氰胺进行高温得到氮化碳，然后利用次氯酸钠水溶液氧化剥离，之后将滤饼溶解在水中进行连续超声，沉淀收集上层液体，上层液体离心收集溶液相，冷冻干燥；将冷冻干燥后的材料加入水中，在油浴条件下滴入六水合氯铂酸，搅拌反应，制备得到铂-碳氮人工生物催化剂，通过控制制备条件以及铂的添加量，使得该催化剂不仅能够降低材料的毒性，同时发挥有效的催化效果。该催化剂将铂簇配备在氮化碳框架上，铂具有更多的d电子，有利于催化过程中化学键形成，以及更多的未占据d轨道在催化过程中接受电子，表现出更高的形成配位配合物的倾向。pt-n配位的活性中心有效地接受和传递电子，具有更出色的催化清除活性氧特性，能够有高效消除干细胞移植后急性缺氧产生的活性氧并改善缺氧环境。

44、2、本技术提供的活性氧清除水凝胶，将丙烯酰化β-环糊精、pbs、明胶、lap以及铂-碳氮人工生物催化剂进行混合，通过控制各个原料的添加量以保证水凝胶良好的稳定性；然后通过紫外光照射进行交联反应，得到活性氧清除水凝胶。具体的，丙烯酰化β-环糊精，可以与明胶通过主客体组装形成水凝胶(acd)作为细胞支架，由于主客体组装特性，细胞可黏附并且在水凝胶中迁移分化生长。将合成的人工生物催化剂加载在主客体组装水凝胶中(pacd)，不仅利于酶模拟活性稳定性，降低生物毒性，而且利于细胞迁移生长，为牙髓再生开辟了新的路径。同时，本技术采用化学物理交联组合的方法，紫外光激发丙烯酰化β-环糊精双键化学交联，丙烯酰化β-环糊精中的空腔和明胶分子中的芳香族残基发生弱主客体物理交联，紫外化学交联(较大作用力)提供凝胶支架稳定性和可注射性，主客体物理交联(较小作用力)利于细胞黏附迁移。使得制备的水凝胶既能改善急性缺氧微环境，清除活性氧，且促进细胞黏附迁移生长并符合临床干细胞移植需求的水凝胶，便于推广应用。

45、3、本技术提供的活性氧清除水凝胶能够有效改善根管牙髓干细胞(dpscs)移植后的急性缺氧环境，特别是其活性氧清除特性，很大程度上避免了缺氧产生的活性氧危害，大大提高牙髓干细胞移植成活率，便于推广应用。