一种利用半纤维素水解液两段式生物法生产木糖醇的方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种利用半纤维素水解液两段式生物法生产木糖醇的方法。

背景技术：

1、木糖醇（xylitol）是自然界天然存在的一种戊糖醇（分子式c5h12o5，分子量为152.15），白色粉末状晶体物质，是人体正常代谢的中间产物，在多种水果、酵母、地衣、海藻、蘑菇和蔬菜中也有存在，但含量较低。目前，木糖醇在食品、医药、化妆品和保健品中都有广泛的应用，其消耗量最大的应用是作为天然甜味剂用于食品行业。随着人们生活水平的提高，肥胖成为困扰大众的普遍问题。消费者越来越青睐于低糖低卡路里的食品，同时木糖醇还具有防龋齿的功效，因此在食品添加剂中的应用越来越多，需求量也越来越大。

2、当前工业上生产木糖醇主要是利用来源于半纤维素水解液中的木糖为原料，经过化学高温高压条件下催化加氢制得。高昂的制备成本推高了木糖醇的售价，并成为制约木糖醇更广泛应用的主要因素。生物法生产木糖醇是一种新型制备木糖醇的工艺，其反应条件温和，生产成本比较低，有望替代传统的化学加氢法生产工艺。

3、近年来已受到了国内外的广泛关注。生物法生产木糖醇主要利用细菌、真菌、酵母或重组基因工程菌等微生物，以不同的生物质原料来发酵获得木糖醇产品。例如，公布号为cn104357339a的中国发明专利申请公开了一种热带假丝酵母，以高浓度木糖为唯一碳源发酵生产木糖醇，木糖醇浓度可达20-65 g/l，残糖浓度低于5%。公告号为cn110982850b的中国发明专利公开了一种米曲霉基因工程菌，以50 g/l木聚糖为唯一碳源，产木糖醇浓度为13.5 g/l，其得率和产率分别为0.27 g/g和0.16 g/l/h。中国公告号为cn106661540b的中国发明专利公开了一种重组奥默毕赤酵母，以250 g/l葡萄糖一水合物为原料，产木糖醇120 g/l、核糖醇5 g/l，木糖醇得率和产率分别为0.48 g/g和1.81 g/l/h。

4、自然界中作为五碳糖最大的生物质原料是半纤维素，以半纤维素水解液来制备木糖醇是最为经济的方案。公布号为cn108949839a和cn111440830a的专利申请公开了大肠杆菌基因工程菌发酵玉米芯水解液（一种半纤维素水解液）、制备木糖醇的技术。但由于半纤维素是以1,4-β-d-吡喃型木糖构成主链，以4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸为支链的多糖，往往还含有l-呋喃型阿拉伯糖基作为支链连接在聚木糖主链上。因此，半纤维素水解液中除了主要含有d-木糖（d-xylose）外，还含有多种杂糖，如葡萄糖（glucose）、l-阿拉伯糖（l-arabinose）等。特别是其中的l-阿拉伯糖，经微生物代谢后会产生l-阿拉伯糖醇、进入木糖醇生产的后续工段，从而增大了木糖醇产品的精制难度，增加了木糖醇产品的制造成本。因此，急需开发基因工程菌及其发酵工艺，加快杂糖的代谢速率，避免杂质l-阿拉伯糖醇的产生，提高木糖醇的得率和产率。

技术实现思路

1、本发明提供了一种利用半纤维素水解液两段式生物法生产木糖醇的方法，该方法利用发酵工程菌中构建的l-阿拉伯糖代谢产木糖醇的途径，以及发酵进程的时间节点控制，使得l-阿拉伯糖可以被充分利用并转化成木糖醇，实现了以半纤维素水解液为原料的两段式生物法生产木糖醇工艺，显著提高半纤维素水解液中木糖醇的得率，为木糖醇生产行业提供了新的推广性更佳的木糖醇生产工艺。

2、具体技术方案如下：

3、本发明提供了一种利用半纤维素水解液两段式生物法生产木糖醇的方法，包括：

4、（1）以半纤维素水解液为原料，在接种有发酵工程菌的发酵培养基中，进行第一阶段发酵培养，直至发酵液中无l-阿拉伯糖残留，得到发酵反应液i；

5、（2）向发酵反应液i中添加葡萄糖补料和诱导剂后，继续进行第二阶段发酵培养，得到含木糖醇的发酵物。

6、本发明方法利用发酵工程菌中的功能基因的表达调控、以及葡萄糖补料和诱导剂添加时间的控制，将发酵工程菌发酵半纤维素水解液产木糖醇的发酵阶段分成了两个阶段；第一阶段，细胞快速增值，并代谢l-阿拉伯糖产木糖醇；第二阶段，诱导细胞产木糖还原酶，从而共代谢木糖和葡萄糖产木糖醇。

7、进一步地，所述发酵工程菌包括：含有木糖还原酶xr基因的宿主细胞和在宿主细胞内共表达的目的基因；所述目的基因包括l-阿拉伯糖异构酶基因 araa、d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因 dpe和l-木酮糖还原酶基因 lxr。

8、本发明方法利用发酵工程菌转化半纤维素水解液生产木糖醇分为两个阶段，第一阶段在发酵工程菌表达的l-阿拉伯糖异构酶、d-阿洛酮糖-3-差向异构酶和l-木酮糖还原酶以及nadh的作用下，将l-阿拉伯糖全部转化为木糖醇；第二阶段受诱导剂的作用，在发酵工程菌经诱导表达的木糖还原酶作用下，半纤维素水解液中未反应的木糖被完全转化为木糖醇。两个阶段结束后，原料的转化率为大于99%；发酵产物无杂糖剩余，且无l-阿拉伯糖醇产生。该方法简化了木糖醇的精制工序，提高了半纤维素水解液生产木糖醇的生产效率以及产品得率。

9、进一步优选，所述基因 araa的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述基因 dpe的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述基因 lxr的核苷酸序列如seq id no.6所示。

10、进一步优选，所述基因 araa的5’非翻译区的核苷酸序列如seq id no.3所示。

11、本发明中，所述l-阿拉伯糖异构酶选自来源于大肠杆菌 e.coliw3110的l-阿拉伯糖异构酶基因 araa核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示；并且，其5’非翻译区（5‘utr）经过改造，获得突变后的5‘utr序列（本发明案例中简写为 araa17），核苷酸序列如seq id no.3所示。所述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，选自来源于根瘤菌 rhizobium sp. rm的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因 dpe，核苷酸序列如seq id no.4所示，氨基酸序列如seq id no.5所示。所述l-木酮糖还原酶，选自原来于酒香酵母 brettanomyces bruxellensisawri1499的l-木酮糖还原酶基因 lxr，核苷酸序列如seq idno.6所示，氨基酸序列如seq id no.7所示。

12、进一步地，所述目的基因在宿主细胞内共表达的方式为下列之一：

13、（a）以重组质粒的形式在宿主细胞内共表达；

14、（b）以表达盒的形式插入至宿主细胞基因组内共表达。

15、共表达基因 araa、基因 dpe以及基因 lxr的方式包括质粒共表达和基因组整合型共表达；进一步优选，所述重组质粒为pbad18。

16、更进一步地，（b）中，目的基因插入至宿主细胞基因组的非编码区内；或者由基因 araa、基因 dpe和基因 lxr随机替代 ptsg基因 、ptsf基因、 xyla和 xylb基因。

17、基因组整合型共表达是将工程菌基因组中葡萄糖转运、代谢相关的基因 ptsg和 ptsf，以及木糖代谢相关的基因 xyla和 xylb分别替换为阿拉伯糖诱导型启动子 pbad以及 araa、 dpe和 lxr基因共表达盒，从而整合到工程菌基因组中。为了提高共表达效率，可以以多拷贝的形式整合到工程菌基因组；本发明中以3拷贝的形式整合到工程菌基因组中作为案例。

18、其中， ptsg的替换减缓了ccr效应、提高了葡萄糖与其他糖类的共代谢效率；葡萄糖的代谢产生辅因子nadph，保证木糖还原酶催化木糖还原为木糖醇时的nadph的供给。 ptsf的替换可以降低木糖醇从胞外到胞内的转运； xyla和 xylb的替换可以阻断木糖的下游分解代谢途径。同时，替换上去的l -阿拉伯糖异构酶基因（ araa17）、d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因（ dpe1）以及l-木酮糖还原酶基因（ lxr8）的表达，强化了l -阿拉伯糖代谢产木糖醇的效率。

19、更进一步地，所述基因 ptsg的核苷酸序列如seq id no.20所示， ptsf的核苷酸序列如seq id no.21所示。

20、更进一步地，所述 xyla和 xylb基因连在一起，在进行替代时，将两个基因一起替代， xyla基因和 xylb基因两个基因合称为 xylab基因，所述 xylab基因的核苷酸序列如seqid no.22所示。

21、本发明方法采用的宿主细胞可以为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等微生物；进一步地，本发明提供的所述宿主细胞为大肠杆菌。更进一步地，本发明提供的所述宿主细胞为大肠杆菌 e.coliw3110。

22、l-阿拉伯糖的代谢途径不只一条，为了进一步加强代谢l-阿拉伯糖产木糖醇的得率，本发明进一步将l-阿拉伯糖代谢的其他路径的相关基因 arab基因、 arad基因和 lyxk基因进行敲除。

23、故进一步地，所述宿主细胞的基因组中至少敲除 arab基因、 arad基因和 lyxk基因中的一种。

24、更进一步地，所述基因 arab的核苷酸序列如seq id no.12所示；所述基因 arad的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述基因 lyxk的核苷酸序列如seq id no.14所示。

25、由于l-阿拉伯糖代谢产木糖醇途径需要消耗辅因子nadh，为了提高l-阿拉伯糖代谢产木糖醇的效率，本发明还将甘油转运蛋白基因 glpf和甘油激酶基因 glpk共表达盒、以及甘油三磷酸脱氢酶基因 glpd表达盒整合至工程菌基因组的非翻译区，以强化甘油代谢产辅因子nadh。

26、进一步地，所述宿主细胞的基因组非编码区内至少插入有甘油转运蛋白基因 glpf、甘油激酶基因 glpk和甘油三磷酸脱氢酶基因 glpd中的一种。

27、更进一步地，所述基因 glpf的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述基因 glpk的核苷酸序列如seq id no.10所示；所述基因 glpd的核苷酸序列如seq id no.11所示。

28、理论上，本发明所采用的木糖还原酶可以为任一来源、在工程菌中能够功能表达且具备相应催化活力的木糖还原酶基因。

29、进一步优选地，所述木糖还原酶基因为来源于博伊丁假丝酵母 candida  boidinii、纤细假丝酵母 candida tenuis cbs 4435、热带假丝酵母 candida  tropicalisifo 0618、粘液红酵母 rhodotorula mucilaginosa、粗糙脉孢菌 neurospora  crassa、乳酸克鲁维酵母 kluyveromyces lactis以及黑曲霉菌 aspergillus niger的木糖还原酶基因，本发明中依次简写为xr1基因、xr4基因、xr5基因和xr6基因，ncbi登录号分别为af451326.3、af074484.1、ab002106.1、alo17776.1、eaa34695.1、aaa99507.1、q9p8r5.1。而表达木糖还原酶所使用的启动子可以为除阿拉伯糖启动子以外的任一诱导型启动子；进一步优选地，所述诱导型启动子为鼠李糖启动子、脱水四环素启动子或乳糖启动子。

30、更进一步地，所述xr基因的诱导型启动子的核苷酸序列为seq id no.15-19所示序列中的一种。

31、进一步地，所述半纤维素水解液由含丰富半纤维素的生物质经水解处理后获得；所述含丰富半纤维素的生物质为玉米芯、造纸短纤维、甘蔗渣、秸秆或稻壳等；所述半纤维素水解液中至少包含l-阿拉伯糖、葡萄糖和木糖。

32、进一步地，所述l-阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的质量比为5%~6%：2%~5%：35%~40%。

33、进一步地，步骤（1）中，所述第一阶段发酵培养的条件为：温度为18~37℃，ph值为6.0~8.0；以接种后初始发酵条件下的溶氧量计100%，控制溶解氧维持在0~50%之间。

34、进一步地，步骤（1）中，所述发酵培养基包括分别含有l-阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的半纤维素水解液，氮源（酵母粉或蛋白胨）、碳源（甘油或葡萄糖）、无机盐（如磷酸盐）等。

35、进一步地，步骤（2）中，以半水解液中的木糖质量计，所述葡萄糖补料的添加量为木糖的10%~50%；所述诱导剂为乳糖、鼠李糖或脱水四环素中的一种，以初始发酵体积计，诱导剂的添加量为1 g/l~10 g/l。

36、作为优选，所述诱导剂为乳糖。

37、进一步地，步骤（2）中，所述第二阶段的发酵培养的条件为：温度为18~37℃，ph值为6.0~8.0；以接种后初始发酵培养条件下的溶氧为100%计，将溶解氧维持在0~50%之间。

38、进一步地，步骤（1）中，所述发酵工程菌接种至发酵培养基时的od600为0.6~0.8，以上罐时初始发酵体积计，接种量为1~15%。

39、本发明中以15 l发酵罐作为发酵容器，将发酵工程菌接种至含有半纤维素水解液的发酵培养基中进行两个阶段的发酵；

40、其中，步骤（1）中，所述发酵培养基至少包括碳源、氮源和无机盐；以初始发酵体积为基准，按体积百分数计，所述碳源的添加量为10～50 g/l；所述氮源的添加量为5～30 g/l；优选的，所述碳源为甘油；优选的，所述甘油的添加量为阿拉伯糖质量的0.6倍以上；

41、步骤（2）中，以水解液中的木糖含量为基准，按质量百分数计，所述葡萄糖补料的添加量为木糖的10%～50%；诱导剂为乳糖、鼠李糖或脱水四环素中的一种；以初始发酵体积为基准，按体积百分数计，诱导剂的添加量为1 g/l～10 g/l。

42、进一步地，第一阶段中，发酵培养基中各组分及浓度为：na2hpo46～10 g/l，kh2po43～5 g/l，甘油6～15 g/l，酵母粉10～30 g/l，蛋白胨5～15 g/l；半纤维素水解液中木糖的终浓度为100～150 g/l；发酵培养的温度为18～37℃，时间为10~20 h；

43、第二阶段中，发酵反应液i中已无l-阿拉伯糖，诱导剂的添加浓度为3～5 g/l，葡萄糖的添加浓度为10~75 g/l；发酵培养的温度为18～37℃，时间为20~60 h。

44、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

45、（1）本发明的两阶段生物发酵法生产木糖醇工艺简便，所用基因工程菌中表达的木糖还原酶基因来源广泛，无需进行突变改造其底物选择性。

46、（2）本发明的基因工程菌发酵半纤维素水解液，l-阿拉伯糖和木糖的转化率超过99%，且无杂糖剩余，产物中也没有l-阿拉伯糖醇，成功地解决了木糖醇精制工序中工艺复杂、分离难度大、成本高的难题。

47、（3）本发明中基因工程菌发酵时能够将半纤维素水解液中的底物l-阿拉伯糖全部转化为木糖醇，充分利用了半纤维素水解液中的杂糖，进一步提升了木糖醇的得率。