用于眼科的人工构建体、获得该构建体的方法及其用途

本发明涉及用于获得人工角膜构建体的方法、通过该方法获得或可获得的角膜构建体、其用途以及能够控制3d打印机根据该方法打印角膜构建体的计算机程序，主要应用于眼科领域。

背景技术：

1、目前，角膜疾病是视力丧失的主要原因之一，影响着全世界超过1500万人。由感染引起的眼部外伤和角膜溃疡是角膜盲的重要原因，这些疾病常未被报道，但可能是导致每年150-200万单眼失明病例的原因。

2、具体而言，在角膜基质的病变主要有以下几种：

3、（a）炎症性病变，如继发于角膜基质的严重结膜炎（沙眼、类天疱疮、特应性角结膜炎、移植物抗宿主病、史-约综合征、春季角结膜炎、水疱性角膜结膜炎和各种形式的眼睑结膜炎等）、病毒性感染性角膜炎（单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、腺病毒）、细菌性角膜炎（真菌和阿米巴原虫）、间质性角膜炎（梅毒和非梅毒（科干综合征、莱姆病、结核病、hsv/vhz、结节病、淋巴瘤））、自身免疫性疾病继发角膜炎（连接性疾病（connectivopathies）（类风湿性关节炎、干燥综合征）、结节病、特发性（蚕蚀性角膜溃疡（mooren's ulcer））等）、角膜外伤（化学性烧伤、异物相关炎症、医源性等）。

4、（b）非炎症性病变，如角膜营养不良、角膜扩张症（角膜炎、角膜球形、透明边缘变性、角膜边缘变性（terrien's marginal degeneration）、lasik术后扩张）、角膜变性（salzmann结节状变性、带状角膜病变）、神经营养性角膜病变、人为性角结膜炎（局部麻醉剂滥用）或肿瘤（角膜cin、绒毛膜瘤、淋巴瘤）。

5、目前，所有这些病症的治疗可能需要进行来自人类供体的角膜移植。这种移植的平均成功率为80%，具体取决于宿主的病理和状况。非炎症性疾病的排斥风险较低，但在全球范围内，对供体角膜的需求远远超过了供应。另一方面，人口老龄化和预期寿命延长意味着高质量的角膜捐赠减少（角膜越来越老），需要移植的角膜更多（预期寿命越长，需要移植的机会就越多）。屈光手术的增加可能会在未来几年加剧这些缺陷，因为迄今为止，用激光治疗的角膜还不适合需要更换角膜基质的移植。

6、这些可获得性和供应问题强调了创造一种人工角膜的必要性，这种角膜可以在未来取代捐赠者的天然角膜。

7、假体的强度和透明度类似于天然基质组织，能够被患者自身的细胞有效地重新填充，并且能够充分地进行生物整合，不会产生排斥或炎症反应，并且具有与天然基质组织相似的生物力学特性，这将代表治疗因基质相关疾病而需要角膜移植和/或被认为具有高排斥风险的患者方面的巨大进步。

8、此外，在炎症性病理的移植中，包括之前的角膜排斥反应，通常与高排斥率有关。对于这些高排斥风险的病例，包括之前移植的多次失败，需要在研究上取得进展，以开发在角膜基质中具有更好生物整合性的新型生物材料。

9、迄今为止，人类供体角膜移植的替代品包括人工替代品（角膜假体），这些替代品已经用于严重眼表病理和移植排斥反应后的视力恢复。

10、尽管近年来提出了许多角膜假体模型，但目前在美国和欧洲只有两种假体模型被广泛植入：骨-牙角膜假体和波士顿角膜假体。这些装置的使用适应症有限，因为现有的假体没有一个能完全融合到宿主组织中，并且可能会出现角膜后膜，最终导致假体挤出、高风险的眼内感染和眼内炎，或青光眼的发展或恶化。

11、或者，近年来，细胞治疗方法也被使用，即移植大量分泌类似于角膜基质的细胞外基质的细胞，这些细胞分泌的量足以再生角膜损伤。从已经表征的基质干细胞中产生角膜基质的可能性已经被提出，但基质干细胞和分化的角膜细胞数量都不多，也不容易在不损伤供体角膜的情况下提取，这使得在健康眼球上进行自体移植变得困难。因此，需要眼外自体干细胞来源。

12、在之前的研究中，这个问题是通过使用眼外来源的细胞治疗方法来解决的：成人脂肪间充质干细胞（adsc）首先通过细胞转移来解决。本发明人证明，adscs在体内分化为角膜基质细胞，并产生适当的胶原和蛋白多糖，但数量很少。接下来，我们使用adsc涂层的聚丙烯酸酯型生物材料生产角膜。尽管这种方法提高了移植物的存活率，但移植物总是会挤出。本发明人先前开发的最有前景的方法是使用供体人角膜片，该角膜片经过脱细胞处理以避免排斥反应，然后用adsc重新细胞化，实现了完全整合和透明度，增加了植入物的稳定性。然而，尽管这种方法允许一个供体角膜用于多个患者，并且事实上已经促进了使用自体adscs的ii期临床试验，但它仍然不能为患者提供无限的角膜假体来源，因为它仍然需要来自供体的组织。

13、最近的研究证明了使用仿生材料（成分和结构与角膜基质相似）作为角膜植入物促进角膜再生的概念，作为兔供体角膜植入的替代方案（liu y., et al., griffith m. asimple cross-linked collagen tissue substitute for corneal implantation.invest ophthalmol vis sci. 2006, 47(5), 1869-1875.15）。植入物由碳化酰亚胺硬化的交联胶原制成，其光学和化学性质与人类角膜相似。当用作移植角膜替代物时，植入物可刺激实验动物角膜组织的再生，而不需要免疫抑制。然而，与人类角膜相比，这些植入物具有明显较弱的拉伸强度（merrett k., et al., griffith m. tissue-engineeredrecombinant human collagen-based corneal substitutes for implantation:performance of type i versus type iii collagen. invest ophthalmol vis sci.2008，49(9)，388738-94）。最近，角膜基质的3d打印得到了发展（isaacson a，swioklo s，connon cj (2018). 3d bioprinting of a corneal stroma equivalent. exp eye res，173:188-193；duarte campos，df，et al.， fuest, m.，(2019). corneal bioprintingutilizing collagen-based bioinks and primary human keratocytes. j. biomed.mater. res. 107 (9)，1945-1953），但是所获得的结果仅仅是体外结果，并不能揭示这些构建体的透明性和强度。

14、在文献cn105034369“三维（3d）角膜基质支撑材料和用于构建三维角膜基质支撑的方法”中，公开了一种三维（3d）角膜基质支撑材料和相应的方法。该材料包含1%-5%的壳聚糖、5%-15%的胶原、5%-15%的聚乙烯醇，以及水至100%。该方法包括建立角膜基质支持物的3d计算机模型和定义打印文件的步骤；制备用作印刷油墨的3d角膜基质支持材料的溶液，并打印连续层以形成打印支持物，将其冻干、交联、清洁和消毒。这种方法在组成上不是仿生的，也没有经过体内试验来证明生物相容性。

15、wo2016049345a1描述了一种从基质细胞和活角膜内皮细胞的培养物制造人工角膜的方法，所述基质细胞和活体角膜内皮细胞通过3d打印封装在两个水凝胶中，并最终结合成单一角膜结构。与前一种方法一样，这种方法提出了一种非仿生方法，使用塑料预聚物溶液，其中期排斥反应是可预测的，正如上述当前的角膜假体所发生的那样。

16、因此，需要提供一种仿生人工角膜构建体，其成分和结构与角膜基质相似，能够允许足够的透明度以使光线通过到达视网膜，具有低排斥率，并且生产过程简单快速，以满足对这些构建体的高需求。

技术实现思路

1、本发明的第一方面提供一种通过三维（3d）打印获得人工角膜构建体的方法，该方法包括以下阶段：

2、i.提供一种以生物墨水形式存在的组合物，其包含浓度在0.2至80mg/ml之间、ph值在3.4至9之间的ⅰ型胶原或ⅰ型、ⅴ型和/或ⅵ型胶原的混合物。此外，所述组合物还任选地包含浓度在1至10μg/ml之间的角膜来源的蛋白多糖，所述蛋白多糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素或其任意组合；

3、ii.通过3d打印，打印包含前一阶段的生物墨水组合物的2至25个连续层。3d打印的特征在于呈现出400至6000µm之间的累积高度，以及每层高度的变化至少是所需的人工角膜构建体每层最终厚度的十倍，其中每层高度的变化可理解为在一层与上一层之间产生的距离；并且生产每一层以获得与上一层胶原纤维方向成70°至110°角的胶原纤维，同时保持生物墨水在不凝胶化的温度下；

4、iii.在30-40℃下培养第ii阶段获得的层状产品，以诱导胶原凝胶化；和

5、iv.在20-40℃的温度和10%至90%的湿度下培养第iii阶段获得的层状产品以诱导该层状产品硬化、压实和/或受控脱水，直到连续层的尺寸在40至600µm之间，每层的厚度在20至25µm之间。

6、在一种实施方案中，获得过程进一步包括在水基溶液中，优选在缓冲溶液中对第iv阶段硬化后的产物进行水合。

7、在根据前述任意一种优选的实施方案中，第ii阶段3d打印的进一步特征在于打印流直径在125-900μm之间，和/或打印速度在0.5-1600mm/s之间的，和/或孔径尺寸在100-600μm之间。打印流直径可理解为在每个生物墨水沉积点处的生物墨水的直径；打印速度可理解为3d打印机在每个点上产生构建体的水平速度；孔径尺寸可理解为层内相邻打印线之间的距离，该距离在层内打印线之间产生生物墨水的自由空间。在一种更优选的实施方案中，通过挤出进行3d打印，喷嘴的直径与打印流的直径一致。可选地，3d打印的特征还在于回缩速度在5-60mm/s之间；和/或运行速度在30-70mm/s之间和/或打印速度在0.5-700mm/s之间。

8、在根据前述任意另一种优选的实施方案中，所述组合物进一步包括：角膜细胞和/或能够分化成角膜细胞的细胞。能够分化成角膜细胞的细胞可以是角膜成纤维细胞、基质成纤维细胞、任何来源的成纤维细胞、基质干细胞、任何来源的间充质干细胞，包括脂肪来源的干细胞（adsc）、角膜基质细胞、任何来源的多能干细胞、胚胎干细胞、任何来源的多能细胞，包括诱导多能干细胞、任何来源的间充质细胞、间皮细胞、角膜缘干细胞、神经嵴细胞和/或间充质干细胞。更优选地，角膜细胞和/或能够分化为角膜细胞的细胞以在1×105-6×105细胞/mm3范围内的浓度存在于组合物中，优选在3×105-5×105细胞/mm3范围内。

9、在根据前述任意一种甚至更优选的实施方案中，胶原是100%的i型胶原或i型、v型和/或vi型胶原的混合物，其比例分别为81%±10%、17%±10%和2%±10%。

10、在根据前述任意另一种优选的实施方案中，每层的最终厚度为20µm±30%，并且其3d打印的特征在于呈现出大约90°的对角加载模式，同时生物墨水的温度保持在2℃和25℃之间或者50℃和60℃之间，优选为4℃。可选地，3d打印的进一步特征在于喷嘴打印流直径为580μm±30%、打印速度为3mm/s±30 %、孔径尺寸为300μm±30%、每层高度变化为1mm±30%、回缩速度为5 mm/s±30%和/或运行速度为40mm/s±30%。在其它甚至更优选的实施方案中，这些范围的变化分别是±20%、±10%、±5%和±1%。

11、本发明的第二方面涉及可获得或根据本发明第一方面的任何获得方法获得的人工角膜构建体。在一种优选实施方案中，该获得或可获得的构建体为长方体或圆柱体的形式，其中，长方体的底部和圆柱体的底部的边长和直径分别在1-20mm之间，更优选在1-13mm之间，甚至更优选在8-10mm之间。

12、本发明的第三方面涉及根据本发明第二方面的用于治疗的人工角膜构建体。

13、在一种优选实施方案中，所述构建体的厚度为100至150μm，它涉及在治疗眼部疾病的方法中的用途，例如角膜炎、角膜边缘变性（terrien's marginal degeneration）、透明边缘变性、蚕蚀性角膜溃疡（mooren's ulcer）、角膜变薄、角膜烧伤、翼状胬肉手术、巩膜或角膜穿孔、以及斜视；在角膜缘移植治疗如角膜缘上皮细胞培养移植（clet）和单纯角膜缘上皮细胞移植（slet）中，在角膜上皮手术或前板层角膜移植术中作为羊膜的替代品，以及在角膜移植手术中作为角膜内皮的支持物或载体，如descemet's膜剥离内皮角膜成形术（dsaek）和/或descemet's膜内皮角膜成形术（dmek）。

14、在另一种优选实施方式中，所述构建体的厚度为100至150μm，它涉及用于治疗眼部疾病的方法中的用途，例如基质移植、完全或穿透性角膜移植(400至600μm)或屈光不正的矫正。

15、本发明的第四方面涉及一种连接到3d打印机的计算机程序。该计算机程序包括计算机可读指令，当由处理器执行时，使处理器执行通过3d打印来打印1至25个连续层的组合物的步骤。生物墨水形式的组合物包含浓度在0.2至80mg/ml之间、ph在3.4至9之间的i型胶原或i型、v型和/或vi型胶原的混合物。所述组合物任选地包含浓度在1至10μg/ml之间的角膜来源的蛋白多糖，所述蛋白多糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素组成的组或它们的任意组合。3d打印的特征在于呈现出200-6000μm的累积高度，并且每一层胶原纤维与前一层胶原纤维方向成70至110°角，同时保持生物墨水在不凝胶化的温度下。