磷酸化多肽的制备方法与流程

本发明大体涉及多肽的化学合成，具体而言，涉及一种磷酸化多肽的制备方法。

背景技术：

1、磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰，对蛋白质功能的完成或改变起到重要的作用。丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)和酪氨酸(tyr)的磷酸化作用是一个可逆的蛋白修饰过程，它们参与调节无数的细胞活动，如包括细胞的增殖发育和分化、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢和肿瘤发生等，然而异常的磷酸化也是引起诸多疾病的起因。研究磷酸化多肽，体现其母体蛋白磷酸化过程结构变化的最好模型，是研究蛋白质磷酸化过程的必不可少的工具。

2、根据磷酸化氨基酸残基的不同，可将磷酸化多肽分为四类，即n-磷酸化多肽、o-磷酸化多肽、酰基磷酸肽和s-磷酸化多肽。o-磷酰化多肽是通过羟基氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸ser、苏氨酸thr或酪氨酸tyr等。

3、目前为止，多肽的o-磷酸化修饰主要有后磷酸化法和单体法两种合成方法(本文后续所有的磷酸化特指o-磷酰化多肽)。后磷酸化法是多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的ser、tyr或thr的侧链羟基进行磷酸化；单体法则是将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中，这种方法较后磷酸化法操作更为简便，已经成为多肽磷酸化修饰的主要方法。但单体法存在磷酸化氨基酸及其后面的氨基酸偶联效率低，尤其是多个连续磷酸化时，缩合困难；此外使用哌啶(pip)脱保护基(fmoc)后出现副反应。

技术实现思路

1、本发明涉及一种磷酸化多肽的制备方法，包括：

2、1)在活化剂和溶剂存在下，将所要合成的多肽的碳末端氨基酸键合到固相载体上，其中所述碳末端氨基酸以fmoc进行基团保护；

3、2)以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分，采用含0.5v/v％～5v/v％dbu和1v/v％～50v/v％tfe的混合试剂脱去保护基，并同下一个氨基酸的活化羧基反应以使肽链延长；

4、3)在最后一个氨基酸偶联结束后，采用所述混合试剂脱去保护基，并用切割试剂将目标磷酸化多肽从所述固相载体上切割下来。

5、现有技术多采用哌啶等弱碱脱fmoc保护基，然而对于fmoc策略磷酸化单体法而言，即便在弱碱条件下，也容易发生β-消除，造成磷酸化氨基酸(特别是丝氨酸或苏氨酸)磷酯基的脱去，进而得不到预期产物。本发明所提供的方法采用0.5v/v％～5v/v％dbu和1v/v％～50v/v％tfe脱保护基，副产物少，所得产物具有更高的纯度。

技术特征：

1.磷酸化多肽的制备方法，包括：

2.根据权利要求1所述的磷酸化多肽的制备方法，所述混合试剂含5v/v％～30v/v％tfe。

3.根据权利要求1所述的磷酸化多肽的制备方法，所述混合试剂含10v/v％～30v/v％tfe。

4.根据权利要求1所述的磷酸化多肽的制备方法，活化羧基所采用的试剂包括eedq和/或iidq。

5.根据权利要求1～4任一项所述的磷酸化多肽的制备方法，以各成分所占体积百分数的比例计算，所述切割试剂为tfa:苯甲硫醚：苯酚：edt：水＝87.5％：2.5％：2.5％：2.5％：5％。

6.根据权利要求1～4任一项所述的磷酸化多肽的制备方法，所述混合试剂所用溶剂选自dmf、nmp、thf和dmso。

7.根据权利要求1～4任一项所述的磷酸化多肽的制备方法，步骤1)中所述溶剂选自dmf、dcm、nmp、乙腈、tfa、哌啶、吡啶、乙醚、二异丙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、dmso、二异丙基乙胺、己烷、水及其组合。

8.根据权利要求1～4任一项所述的磷酸化多肽的制备方法，步骤1)中所述活化剂包含eedq和dmap。

9.根据权利要求8所述的磷酸化多肽的制备方法，步骤1)中所述活化剂包含0.5mmol～1.5mmol的eedq和0.005mmol～0.015mmol的dmap。

10.根据权利要求1～4、9任一项所述的磷酸化多肽的制备方法，所述固相载体为王树脂、ctc树脂、phb树脂、hmpa树脂、hmpb树脂、rink acid树脂、tentageltga树脂和tentagels phb树脂中的任一种或其组合。

11.根据权利要求1～4、9任一项所述的磷酸化多肽的制备方法，在步骤2)和3)中，通过茚三酮检测、四氯苯醌检测和定量hplc分析中的至少一种监控偶联和/或去偶联。

12.根据权利要求1～4、9任一项所述的磷酸化多肽的制备方法，所述方法还包括：4)将所得粗品纯化并冷冻干燥。

13.根据权利要求1～4、9任一项所述的磷酸化多肽的制备方法，所述磷酸化多肽中含有2个或更多个磷酸化残基。

技术总结本发明大体涉及多肽的化学合成技术领域，具体而言，涉及一种磷酸化多肽的制备方法。该方法包括：1)在活化剂和溶剂存在下，将所要合成的多肽的碳末端氨基酸键合到固相载体上，其中所述碳末端氨基酸以Fmoc进行基团保护；2)以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分，采用含0.5v/v％～5v/v％DBU和1v/v％～50v/v％TFE的混合试剂脱去保护基，并同下一个氨基酸的活化羧基反应以使肽链延长；3)在最后一个氨基酸偶联结束后，采用所述混合试剂脱去保护基，并用切割试剂将目标磷酸化多肽从所述固相载体上切割下来。技术研发人员：王克全受保护的技术使用者：南京金斯瑞生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/12