一种含卡比多巴的药物中致突变杂质肼的检测方法

本发明属于医药化工领域，更具体地涉及一种含卡比多巴的药物中致突变杂质肼的分析检测方法。

背景技术：

0、技术背景

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、肼(又称联氨)，化学结构式为h2n-nh2，为无色油状液体，有类似于氨的刺鼻气味，是一种强极性化合物，该物质是一种腐蚀性和致癌物质，肼为2a类致癌物清单中物质。根据国际人用药品注册技术要求协调会(ich)相关指导原则，肼的可接受摄入量(ai)或每日允许暴露量(pde)为0.2(吸入)或39μg/天(所有其他途径)。

3、在药物合成过程中，特别含肼类结构的化合物，如卡比多巴、异烟肼、别嘌呤醇、硫酸双肼屈嗪等，可能因合成起始物料带入或化合物降解等途径，使得在原料药或药物制剂中有微量致突变杂质(又称基因毒性杂质，简称基毒杂质)肼残留的可能，威胁人体服用该类药物成分的安全性，因此，对肼的检测和合理控制是该类药物研制过程中非常重要的一环。

4、由于肼为强极性化合物，在液相色谱分离中呈现明显弱保留性，难以直接检测，且该物质化学结构中不含任何发色基团，常规紫外检测器或荧光检测器均不能直接应用于检测该物质。因此，现阶段对肼的检测大多采用衍生化试剂，通过与肼衍生形成具有紫外吸收或荧光吸收的衍生物后，进而再通过高效液相色谱仪等进行定量检测。

5、针对含肼或肼基团原料药或药物制剂的潜在致突变杂质肼的分析检测方法，现阶段多以醛类化合物为衍生化试剂，如苯甲醛、水杨醛、5-硝基糠醛、邻苯二甲醛、2,3-萘基二缩醛、五氟苯甲醛等，这是由于醛类衍生化试剂可与肼能快速反应，并形成较稳定具紫外吸收的衍生物，其中，应用最广泛和相对较为成熟的是以苯甲醛为衍生化试剂，这也被收载入了这类药物成分杂质肼检测的药典质量标准，如异烟肼、别嘌呤醇、硫酸双肼屈嗪药物的欧洲药典(ep)。苯甲醛与肼的衍生化反应机理为，肼与苯甲醛在常温条件下即可快速形成具有紫外吸收的二苄肼，具体衍生反应过程如下所示：

6、

7、但是，与异烟肼、别嘌呤醇、硫酸双肼屈嗪等化合物不同的是，卡比多巴化合物结构上含有肼基团，且位于脂肪链上，这种结构特征就使得在以苯甲醛为衍生化试剂的反应中，衍生化试剂除了与致突变杂质肼反应外，还可与卡比多巴结构上的肼基团反应，并最终形成相同的二苄肼衍生物，进而影响了药物中实际存在基毒杂质肼的含量检测结果。卡比多巴参与衍生化反应的机理如下所示：

8、

9、即苯甲醛首先与卡比多巴化学结构上的肼基团一侧反应，然后苯甲醛继续进攻其脂肪链上另一侧肼基团，并使其从脂肪链上脱掉，形成二苄肼。由于苯甲醛活性较强，与卡比多巴相对较易反应，这使得该反应时间差非常短，难以控制卡比多巴与杂质肼参与衍生反应的时间间隔，导致卡比多巴生成的二苄肼衍生物干扰杂质肼的定量检测结果。

10、因此，在卡比多巴原料药中基毒杂质肼的检测中，通常首先需经复杂的分离手段，使原料药与可能存在的基毒杂质肼分离后，再单独对含肼的分离液进行衍生化处理后检测，如卡比多巴原料药的英国药典(bp)质量标准中，基毒杂质肼的检测方法为先充填制备离子交换树脂层析柱，利用卡比多巴与肼在层析柱中保留性差异，去除保留性较强的卡比多巴成分，从而分离得到弱保留性的含肼分离液，然后再以水杨醛为衍生化试剂进行衍化处理，最后采用薄层色谱法与同样经衍生化的对照品溶液进行荧光显色对比。该方法针对卡比多巴原料药中基毒杂质肼检测的优点在于可较大程度避免衍生化过程中主成分的干扰，缺点在于前期层析分离过程较繁杂，且易存在因杂质肼在分离过程中的损失，而出现低于实际含量的情况。

11、虽然针对卡比多巴原料药中基毒杂质肼的检测而言，可以采用离子交换树脂对弱保留性的肼进行分离后再进行衍生后的检测，但是上述操作繁琐，并且对于同时含卡比多巴和其它辅料的药物制剂而言，这种方式却不可行，其原因在于制剂样品中含有较多辅料成分，如填充剂、黏合剂、崩解剂等，这就使得供试品溶液呈非溶液状，而为具有一定粘度的溶液，供试品溶液难以顺利通过层析柱，也不能有效分离出含肼的分离液。因此，现阶段针对含卡比多巴药物制剂中致突变杂质肼的检测仍然采用以苯甲醛为衍生物的分析检测方法，利用苯甲醛与卡比多巴的反应速率相较于与肼略慢的特点，通过异常精准的操作时间控制，如以精确至10～15秒的时间差，以及扣除主成分存在的相对固定的基础干扰值，来进行这类药物制剂中基毒杂质肼的检测分析，而这种方式除了对操作要求异常高外，也仍会因不同操作时间差，导致检测波动大等问题。

12、因此，如何提供一种受卡比多巴主成分干扰小、准确度和检测灵敏度高，且具有良好稳定性和操作便捷的分析检测方法，对含卡比多巴药物制剂中微量致突变杂质肼的定量检测具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种检测灵敏度高、准确度好、且对操作时间可控、稳定性好的致突变杂质肼的分析检测方法，为含卡比多巴的药物制剂中含该类杂质的定量检测提供了更加可靠的技术支持。

2、本发明开发了以2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈为衍生化试剂的肼类杂质含量的分析检测方法，能够准确检测含卡比多巴制剂中微量肼，加入衍生化试剂后无需需要严格控制反应时间，反应步骤简单易于操作。

3、本发明具体技术方案如下：

4、本发明公开了2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈在制备含卡比多巴的药物中杂质肼hplc检测的柱前衍生化试剂中的应用。

5、2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈的化学结构式如下所示：

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7、肼分子与2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈发生亲核取代反应，使2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈分子结构式苯环上的氟被肼取代，从而形成一种新的苯肼类物质。

8、本发明所述药物可以为含卡比多巴的原料药或者含卡比多巴的药物制剂。

9、进一步的，本发明公开了含卡比多巴的药物中杂质肼hplc检测的柱前衍生化方法，以2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈为衍生化试剂与杂质肼反应生成生成2-甲基-5-硝基-4-肼基苯腈。

10、所述方法包括将2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈加入含卡比多巴的药物的溶液，在碱性条件下，30～40℃反应12.3～13.5min，调节反应液至酸性中止反应。

11、优选的，反应温度为35℃、反应时间为13.0min。

12、优选的，反应体系中卡比多巴药物浓度为0.33～0.5mg/ml，2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈浓度为0.2-0.5μg/ml。

13、优选的，该衍生反应所述碱性条件是ph为7.6±0.2。

14、本发明所述的方法一个具体的示例，包括如下步骤：

15、精密量取1单位体积供试品溶液，精密加入1单位体积2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈溶液和4单位体积ph 8.2硼酸盐缓冲液，置30～40℃水浴振摇12.3～13.5min后，取出立即加入5单位体积的0.1mol/l冷盐酸溶液，并冷却至室温。

16、本发明另一目的在于提供一种含卡比多巴的药物中杂质肼hplc检测方法，采用本发明所述的方法对卡比多巴药物中杂质肼进行柱前衍生化，以具紫外检测器的高效液相色谱仪为检测仪器，十八烷基硅烷键合硅胶或性能相当填充剂为色谱柱，检测波长为280～320nm，流动相为乙腈-0.05％乙二胺四醋酸二钠水溶液(55：45，v/v)，进行等度洗脱。

17、一个具体的示例，色谱柱为upelco lichrospher 100rp(4.0mm×125mm，5μm)，检测波长为300nm，柱温为20～40℃，流速为0.8～1.2ml/min。

18、具体地，本发明对含卡比多巴的药物中致突变杂质肼的分析检测包括以下步骤：

19、(1)溶液的配制：

20、稀释剂：乙腈-水(1：1)。

21、硼酸盐缓冲液(ph 8.2)：取硼酸3.09g和氯化钾3.73g，置1000ml量瓶中，加入0.2mol/l氢氧化钠溶液60ml，加水稀释定容至刻度，摇匀，即得。

22、衍生化溶液：取2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈适量，精密称定，置适宜量瓶中，加乙腈溶解并定量稀释至刻度，摇匀，配制含2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈约为1.3～3.0μg/ml的衍生化溶液。进一步的，所述衍生化溶液，优选浓度为2μg/ml的衍生化溶液。

23、供试品溶液：取含卡比多巴制剂的供试品适量(约相当于卡比多巴25mg)，经适宜方式研磨或提取后，置适宜量瓶中，加稀释剂溶解并定量稀释至含卡比多巴约为2～3mg/ml的溶液，滤过，即得。进一步的，所述供试品溶液，优选浓度为2.5mg/ml的供试品溶液。

24、对照品溶液：精密称取二盐酸肼对照品适量，置适宜量瓶中，加稀释剂溶解并定量稀释至含二盐酸肼约为0.5～1.0μg/ml的溶液。进一步的，所述对照品溶液，优选浓度为0.8μg/ml的对照品溶液。

25、衍生化程序：精密量取对照品溶液和供试品溶液各1ml，分别置25ml具塞锥形瓶中，精密加入衍生化溶液1ml和ph 8.2硼酸盐缓冲液4ml，置30～40℃水浴振摇12.3～13.5min后，取出立即加入5ml的0.1mol/l冷盐酸溶液(2～8℃)，并冷却至室温。进一步的，所述衍生化程序，优选水浴温度为35℃、水浴振摇13.0min。

26、(2)色谱条件：

27、仪器：高效液相色谱仪；

28、色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(supelco lichrospher 100rp，4.0mm×125mm，5μm或效能相当的色谱柱)；

29、检测波长：280～320nm，优选300nm；

30、进样体积：10～30μl，优选20μl；

31、流速：0.8～2.0ml/min，优选1.2ml/min；

32、柱温：20～40℃，优选30℃；

33、流动相：乙腈-0.05％乙二胺四醋酸二钠水溶液(55：45)；

34、(3)测定法：

35、精密量取衍生后的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算肼含量(肼与二盐酸肼的换算系数为0.3053)。

36、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

37、1.本发明所采用的2-甲基-5-硝基-4-氟苯腈衍生化试剂，与卡比多巴化学结构上的肼基团发生亲核取代的反应速率明显慢于与潜在致突变杂质肼的反应速率，并利用衍生条件的改变，有效避免了卡比多巴化学结构上肼基团持续参与衍生反应，防止其对实际样品中潜在致突变杂质肼的检测干扰，大大提高了样品检测的准确性。

38、2由于本发明所述的衍生化试剂与肼或卡比多巴发生衍化反应的条件具有一定的酸碱度及温度限制、且作用时间较长，从而可通过反应环境的调节，可有效阻滞衍生反应的持续作用，因此，在检测操作过程中无需过于严格精确地控制样品处理及检测时间，提高了样品检测的可操作性和便捷性。