SARS-CoV-2冠状病毒囊膜表面S蛋白抗原表位及其单克隆抗体的制备筛选方法和应用

本发明属于生物医学技术和免疫诊断检测，具体涉及sars-cov-2冠状病毒囊膜s蛋白抗原表位及其单克隆抗体的制备筛选方法和应用。

背景技术：

1、1975年，德国学者g和阿根廷学者c milstein利用杂交瘤技术首次在小鼠上产生了抗未知抗原表位(决定族)的单克隆抗体(mab)。单克隆抗体的出现彻底改变了包括癌症、自身免疫病和传染病等多种人类疾病的诊断和治疗方法。单克隆抗体制剂作为靶向治疗药物，具有特异性强、疗效显著及毒性低等特点，被誉为“生物导弹”，具有广阔的应用前景。在应对病毒性传染病上，具有中和作用的单克隆抗体，可以特异性的中和病毒，阻止病毒进入细胞增殖，既可以作为早期感染预防，也可以用于病毒感染后疾病的干预治疗。

2、sars-cov-2病毒囊膜的刺突蛋白(spike protein,s蛋白)是病毒入侵毒力相关的重要结构蛋白，位于病毒最外层结构，s蛋白含有s1和s2两个功能亚基，s1亚基内的受体结合域(receptor binding domain,rbd)与宿主细胞的血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ace2)相互作用，发挥受体结合功能；s2亚基具有脂质修饰的功能，介导病毒囊膜与细胞膜融合，从而使病毒进入宿主细胞。目前，针对sars-cov-2的mab主要靶向病毒s蛋白rbd，rbd位于sars-cov-2病毒囊膜刺突蛋白的头部，针对rbd的特异性mab可识别sars-cov-2s蛋白rbd，事实上，rbd存在不同的抗原表位，上述mab特异性识别rbd的精准抗原表位未知，能竞争结合sars-cov-2，阻断病毒与ace2的结合，有效实施抗病毒感染的目的。值得注意的是，sars-cov-2体内感染传播迅速的同时，不断出现新突变株使单克隆抗体药物失去不同程度的竞争结合活性，因此，传统经典的单克隆抗体的研发思路可能难以应对新冠病毒的快速变异，迫切需要发展基于抗原表位靶向的精准、简便、快速、成本低廉以及针对性强的单克隆抗体制备筛选方法。

3、在整个单克隆抗体制备的过程中，涉及两个值得关注的重要环节，包括免疫抗原制备和单克隆抗体的筛选，其一是免疫抗原制备，用于免疫小鼠和获得制备杂交瘤细胞的免疫小鼠b细胞，抗原免疫小鼠后，在进行细胞融合之前需要测定免疫血清效价，并筛选免疫反应较好、血清效价高的免疫小鼠来进行后续的脾脏b细胞制备和杂交瘤细胞融合，而免疫抗原通常采用完整的蛋白质(抗原)，包括抗原表位和不能特异性识别抗体的冗余成分。其一，我们期待在完整的蛋白质表面存在已知的优势抗原表位，亲水性氨基酸残基基团暴露性好，无其他空间结构构象遮蔽，就能直接高效诱导宿主产生先天性和获得性免疫应答。其二是单克隆抗体的筛选，在脾脏b细胞和骨髓瘤细胞融合以后，需筛选能分泌针对特定抗原表位的抗体的杂交瘤细胞，目前最常用的方法仍然是经典的间接elisa法，有时也会使用间接免疫荧光法(ifa)，虽然应用普遍，但却需要酶标仪、酶标二抗、显色液等仪器试剂，且存在操作繁琐、工作量大、耗时、费力等缺点，尤其是elisa和ifa等方法来进行筛选单克隆抗体，由于其检测抗原为完整的蛋白质，单克隆抗体识别完整的蛋白质抗原的反应过程中，如何精准确定与单克隆抗体识别反应的抗原表位，值得探索研究和技术需求。

4、因此需要对现有的单克隆抗体研发的抗原制备和检测筛选技术进行改进，以简化实验步骤，精准提高筛选效率。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种sars-cov-2冠状病毒囊膜表面s蛋白抗原表位及其单克隆抗体的制备筛选方法和应用。

2、技术方案：本发明提供了sars-cov-2冠状病毒囊膜表面s蛋白的抗原表位sg10，其氨基酸序列为snnldskvgg。

3、本发明还提供了编码所述的抗原表位sg10的核酸分子，所述核酸分子的基因序列为tctaacaatcttgattctaaggttggtggt。

4、本发明还提供了表达盒、重组载体、重组菌株，其含有所述的核酸分子。

5、本发明还提供了所述的重组菌株或一种免疫抗原，所述重组菌株或免疫抗原是将所述的核酸分子插入沙门氏菌v型分泌系统misl载客域，然后导入宿主菌中在菌体表面表达展呈sg10表位；所述在菌体表面表达展呈sg10表位而替代完整蛋白质抗原作为优势免疫抗原；

6、本发明还提供了重组菌株或一种检测抗原，所述重组菌株或检测抗原是将核酸分子插入沙门氏菌peg菌毛操纵子基因并导入惰性载体s9菌在s9菌体表面功能性表达展呈。

7、其中，所述的表达sg10表位的重组s9菌，能特异性识别分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞上清，产生sg10表位-单克隆抗体直接介导的特异性凝集反应，精准和便捷地筛选出分泌抗sg10表位的单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。

8、本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为分泌针对权利要求1所述抗原表位sg10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202316，保藏日期是2023年1月7日，分类命名为杂交瘤细胞株4g8g5(hybridoma cell line 4g8g5)，所述杂交瘤细胞株4g8g5是靶向sars-cov-2s蛋白snnldskvgg表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏地址是中国，武汉，武汉大学。

9、本发明还提供了一种抗sg10表位的单克隆抗体，所述单克隆抗体是将权利要求3所述的免疫抗原免疫动物得到；或由所述的杂交瘤细胞株分泌获得。

10、本发明还提供了所述的抗sg10表位的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：选择8～10周龄的雌性balb/c小鼠，腹腔注射液体石蜡，7～10天后腹腔注射处于对数生长期的所述的杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显膨胀后收集腹水，离心去除细胞碎片和其他沉淀物，取上清经纯化后得到针对新型冠状肺炎病毒s蛋白rbd中sg10表位的单克隆抗体。

11、本发明还提供了所述的s蛋白的抗原表位sg10、所述的核酸分子、所述的表达盒、重组载体或重组菌株、所述的重组菌株或免疫抗原、所述的重组菌株或检测抗原、所述的杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在制备检测sars-cov-2冠状病毒或其抗体的试剂或试剂盒中的应用。

12、本发明还提供了一种检测sars-cov-2冠状病毒或其抗体的试剂盒，所述试剂盒包括所述的s蛋白的抗原表位sg10、所述的核酸分子、所述的表达盒、重组载体或重组菌株、所述的重组菌株或免疫抗原、所述的重组菌株或检测抗原、所述的杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体。

13、本技术实现要素：提供了一种抗sars-cov-2冠状病毒囊膜表面s蛋白snnldskvgg表位的单克隆抗体的制备筛选方法，包括以下步骤：

14、1)免疫抗原：将sg10表位插入沙门氏菌v型分泌系统misl载客域，在菌体表面表达展呈sg10表位作为优势免疫原；

15、2)动物免疫：balb/c小鼠颈背部皮下注射表达sg10表位的重组菌株，剂量为1×108cfu/0.1ml/只，每次免疫间隔12天，一共免疫3次；

16、3)表达sg10表位的重组s9菌(检测抗原)：将sg10表位插入沙门氏菌peg菌毛操纵子基因并导入惰性载体s9菌，该sg10表位能在s9菌体表面功能性表达展呈，基于表达sg10表位的重组s9菌作为检测抗原，建立sg10表位识别和直接介导的凝集试验检测方法；

17、4)sg10表位-抗体直接介导的玻板凝集试验：表达sg10表位的重组s9菌，其菌体表面的sg10表位识别抗小鼠血清中抗sg10表位的特异性抗体，产生凝集反应，定性定量监测免疫小鼠血清snnldskvgg表位特异性抗体及抗体滴度；

18、5)免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合：取第三次免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行体外融合，分别在含有hat和ht的培养基中进行培养筛选；

19、6)sg10表位-单克隆抗体直接介导的玻板凝集试验，筛选分泌抗sg10表位的特异性抗体的杂交瘤细胞株：若表达sg10表位的重组s9菌检测抗原能够观察到白色凝集颗粒，对照系统(仅缺失sg10表位的重组s9菌)无反应，则判定为阳性；阴性结果无白色凝集颗粒；记录筛选结果，挑选分泌抗sg10表位的特异性抗体的阳性杂交瘤细胞；

20、7)杂交瘤细胞株的亚克隆：将步骤6)中筛选出的阳性杂交瘤细胞，利用有限稀释法进行3次亚克隆，直至亚克隆培养板中的所有孔均检测为阳性，最终筛选到可稳定分泌针对sars-cov-2囊膜s蛋白snnldskvgg表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为4g8g5)；

21、8)特异性单克隆抗体的制备与纯化：培养杂交瘤细胞株4g8g5一定数量，离心去除细胞碎片杂质和其他沉淀物，取上清经纯化后得到抗sars-cov-2囊膜s蛋白snnldskvgg表位的单克隆抗体，sg10表位—单克隆抗体直接介导的玻板凝集试验测试和验证，和vero e6细胞感染sars-cov-2的间接免疫荧光方法验证该单克隆抗体特异性。

22、其中，所述步骤8)的特异性抗体的制备与纯化的具体方法为：选择8～10周龄的雌性balb/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.3ml/只，7～10天后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞，注射1×106个细胞/只；待小鼠腹部明显膨胀后收集腹水，离心去除细胞碎片和其他沉淀物，取上清经纯化后得到针对新型冠状肺炎病毒s蛋白rbd中sg10表位的单克隆抗体。

23、有益效果：本发明提供了一种抗sars-cov-2冠状病毒囊膜表面s蛋白snnldskvgg表位的单克隆抗体的制备筛选方法。与现有技术相比，本发明具备以下优点：

24、(1)本发明中所用免疫抗原，无需进行大量蛋白质抗原的抽提、表达和纯化，免疫注射时无需添加免疫佐剂，且仅需免疫小鼠3次。

25、(2)本发明在分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞筛选过程中，无需利用elisa，仅采用玻板凝集试验，即可方便、快捷和肉眼可视化筛选出能分泌针对sars-cov-2囊膜s蛋白snnldskvgg表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞，而与sars-cov-2冠状病毒囊膜表面s蛋白的其他2种抗原表位(qagst和qagstpc)、以及1种sg10表位的突变体(snnldsavgg，下划线表示表位中一氨基酸的突变位点，由k突变为a)的抗原表位不发生非特异性结合。