一种金鱼脑细胞系GFB的体外培养方法和应用与流程

本发明涉及细胞培养，具体涉及一种金鱼脑细胞系gfb的体外培养方法及其应用。

背景技术：

1、金鱼属于鲤形目鲤科。起源于中国，是观赏鱼中最早的品种。金鱼是从野生鲫鱼驯化而来的观赏鱼类。金鱼除了提供观赏作用以外，还对生物变异、基因遗传进化、胚胎发育等方面提供了科学研究的价值。

2、鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2，cyhv-2)是引起鲫和金鱼造血器官坏死病的病原，在世界多个国家传播、流行，给鲫、金鱼和异育银鲫养殖业造成巨大经济损失。细胞分离病毒被认为是病毒鉴定的金标准，代表着最准确的诊断方法。目前，鲤疱疹病毒2型病毒分离多数使用其它鱼类传代细胞系，缺乏金鱼组织来源的传代细胞系。yexu等(invitro cellular&developmental biology-animal(2019)55：749755)采用金鱼脑组织建立金鱼细胞系，在用来自与鲤疱疹病毒2型(cyhv-2)爆发的隐性或死亡金鱼的组织匀浆接种后的10代以上连续观察到细胞病变效应，从而使该细胞系可用作监测病毒性疾病的生物工具。但是该方法中的细胞系构建的方法细胞迁出率和生长率均较差，限制了其作为实验材料的推广应用。

3、有鉴于此，因此，有必要开发一种具有高细胞迁出率和生长率的金鱼脑细胞系的体外培养方法，从而为金鱼基因功能和金鱼易感病毒的研究提供稳定性和敏感性好的实验材料。

技术实现思路

1、有鉴于此，为解决上述问题，本发明提供了本发明要解决的技术问题是提供一种金鱼脑细胞系gfb的体外培养方法和应用，该体外培养方法采用金鱼脑组织作为原材料，培养金鱼细胞具有高细胞迁出率和生长率的特点，从而鞥能够为金鱼基因功能和金鱼易感病毒如鲤疱疹病毒2型研究提供丰富的实验材料。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种金鱼脑细胞系gfb的体外培养方法，包括采用灭菌铜网覆盖法使所述金鱼脑组织块贴附于灭菌铜网的表面，构建得到所述金鱼脑细胞系。

3、具体地，以健康的成年金鱼脑组织为材料，将所述金鱼脑组织剪碎后得到金鱼脑组织块进行贴壁培养，采用灭菌铜网覆盖所述金鱼组织块使所述金鱼脑组织块贴附生长，促进所述金鱼脑细胞的迁出，进而促进金鱼脑原代细胞的生长，构建得到所述金鱼脑细胞系。

4、更具体地，采用上述的金鱼脑细胞系gfb进行体外培养方法，包括以下步骤：

5、步骤(1)，原代培养：将所述金鱼脑组织块单层平铺后覆盖所述灼烧法灭菌铜网让所述金鱼脑组织块贴附生长；然后加入所述原代培养基进行原代培养，待得到原代细胞；

6、步骤(2)，传代培养：将所述原代细胞用胰蛋白酶消化后，加入所述原代培养基进行传代培养；在传代10次后更换为生长培养基，得到传代细胞；

7、步骤(3)，细胞冻存；所述传代细胞生长到对数期时收集并进行第三次重悬，得到的第三细胞悬液；所述细胞悬液离心后将沉淀加入冷冻培养基进行密封冻存，得到所述金鱼脑细胞系。

8、优选地，步骤(1)中，所述金鱼脑组织块的获取包括无菌采集健康金鱼的脑组织后进行洗涤；再将所述脑组织剪碎成所述金鱼脑组织块放入无菌离心管中并加入胰蛋白酶溶液进行消化和一次离心得到的沉淀加入所述原代培养基进行第一次重悬后得到第一细胞悬液再进行二次离心，离心后的沉淀物即为所述金鱼脑组织块。

9、优选地，所述消化包括加入所述金鱼脑组织块的两倍体积的0.25％的胰蛋白酶溶液，25℃消化5min。

10、优选地，所述金鱼脑组织块的大小为1-2mm3。

11、优选地，所述洗涤包括将所述金鱼脑组织依次用75％乙醇和漂洗培养基进行清洗；更优选地，所述漂洗培养基为含有400iu/ml青霉素、400μg/ml链霉素及500μg/ml制霉菌素的m199培养基；

12、优选地，所述灼烧法灭菌铜网的灭菌方法包括将铜网先在75％的乙醇中浸泡3～5分钟，再用火焰灼烧2～3秒后利用进行灭菌，得到灭菌铜网；优选地，所述铜网的孔径5mm；

13、优选地，所述原代培养基为添加20％胎牛血清、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10μg/ml成纤维细胞生长因子和10μg/ml表皮生长因子的m199培养基。

14、优选地，步骤(2)中，所述生长培养基为添加有10％胎牛血清的m199培养基。

15、优选地，所述传代培养的周期为7到10天。

16、优选地，所述传代培养包括将铺满单层的所述原代细胞，用所述胰蛋白酶消化后，加入所述原代培养基吹下贴壁细胞并进行第二次重悬，将得到的第二细胞悬液进行所述传代培养即得到所述金鱼脑细胞系。

17、优选地，所述金鱼脑细胞系每隔7到10天传代。

18、优选地，步骤(3)中，包括当所述传代细胞的生长到对数期时，收集并进行所述第三次重悬至5×106～6×106细胞/ml，得到的所述第三细胞悬液在1000rpm离心10min，沉淀用所述冷冻培养基进行第四次重悬，得到的第四次细胞悬液进行分装后密封冷冻保存。

19、优选地，所述冷冻培养基包括10％二甲基亚砜和90％胎牛血清。

20、优选地，所述冷冻保存的方法包括：使用4℃预冷的冻存盒将存放所述金鱼脑细胞系的冻存管在24h缓慢降温到-80℃，然后转移到液氮中保存。

21、优选地，所述金鱼脑细胞系的复苏方法包括：将冷冻保存的所述金鱼脑细胞系取出后于25℃融化，重新接种到含有所述生长培养基的细胞瓶中，第二天更换新鲜的所述生长培养基。

22、尤其地，基于上述的体外培养方法成功培养一株金鱼脑细胞系，该细胞系2天可以长满细胞瓶底，每7到10天传代一次。

23、作为一种优选的实施方式，采用上述体外培养方法培养得到的金鱼脑细胞系gfb，在液氮中保存1年后，25℃培养贴壁生长存活率94％以上。

24、优选地，所述金鱼脑细胞系的生长温度为25～30℃；更优选为30℃。

25、优选地，所述金鱼脑细胞系可连续传代，至少可传代200代。

26、另外，采用本发明提供的体外培养方法培养的金鱼脑细胞系，可以应用于金鱼易感病毒如鲤疱疹病毒2型的分离培养，该方法敏感性好、且易于操作，尤其地，连续传代l0次后依然能够观察到鲤疱疹病毒2型的细胞病变。

27、本发明所获得的有益技术效果：

28、1.采用本发明技术方案，通过体外培养方法主要包括是采用灼烧法灭菌铜网覆盖组织块的方法够得到较高的细胞迁出率和生长率，为鲤疱疹病毒2型等危害金鱼养殖的病毒病研究提供了一种敏感性好、易于操作的实验材料。

29、2.采用本发明提供的体外培养方法培养得到的金鱼脑细胞系可以连续传代，至少可传代200代，且细胞增殖稳定，可以进行冷冻保存及细胞复苏，在液氮保存13个月之后冻存细胞的复苏存活率＞90％；尤其能够提供大量的细胞并将其用于鱼类病毒的分离培养、抗体制备以及治病机理等研究。

30、3.采用本发明技术方案，得到的金鱼脑细胞系可以用于金鱼病毒病的诊断，接种鲤疱疹病毒2型后能够观察到细胞病变，连续传代10次后依然能够观察到细胞病变。