一种可注射软组织再生填充剂及其制备方法与流程

本发明属于组织工程，具体涉及一种可注射软组织再生填充剂及其制备方法。

背景技术：

1、随着近年来组织工程和再生医学的快速发展，可注射软组织填充材料越来越受到广泛关注。通过注射软组织填充材料可以实现面部整形的软组织填充、慢性创面修复、骨关节炎治疗、关节软骨缺损修复、肌腱损伤修复、心肌损伤修复、脊髓损伤修复及脑组织损伤修复等临床疾病的微创治疗。再生丝素蛋白是一种天然高分子材料，具有优良生物相容性和生物可降解性。特别地，再生丝素蛋白可塑性卓越，机械性能好，可以加工成薄膜、海绵、凝胶、微粒等不同形态为细胞和组织生长提供强大支撑和引导，因此，如果将再生丝素蛋白制备成一种软组织填充剂应用于组织工程和再生医学领域将具有极大的应用潜力和市场前景。

2、虽然再生丝素蛋白是由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等18种氨基酸组成，其主要的二级结构也具有类似于胶原蛋白的纳米纤维结构，但是由于其氨基酸序列中不含有促进细胞黏附、增殖、分化的肽序列，所以需要通过对其修饰、改性或与其它材料进行复合来改善再生丝素蛋白的生物活性，提高再生丝素蛋白诱导组织再生的能力。

3、重组人源化胶原蛋白是利用基因工程和合成生物学技术开发的具有与人源胶原蛋白高度相似氨基酸序列的一种蛋白质分子。与天然提取的动物源胶原蛋白相比较，重组人源化胶原蛋白相较于传统的动物源胶原蛋白具有多方面的优势。在生物相容性方面，重组人源化胶原蛋白的结构与人自身产生的胶原蛋白高度相似，因此具有更好的生物相容性，减少了人体排异反应的风险；生物安全性方面，由于是通过基因工程技术生产的，避免了从动物体内提取胶原蛋白可能带来的病毒隐患和病原体残留问题，提高了产品的安全性；重组胶原蛋白还具有低免疫原性，由于重组人源化胶原蛋白的生产过程可以控制胶原蛋白的结构和序列，从而降低了免疫原性，减少了过敏反应的可能性；另外，重组人源化胶原蛋白还具有产品纯度高、稳定性好、易于加工存储和可规模化生产等一系列优势。因此，重组人源化胶原蛋白在医疗、美容、护肤等多个领域都有广泛的应用潜力，如用于创面修复、组织填充等。进一步，如果运用创新技术将再生丝素蛋白和重组人源化胶原蛋白复合，制备成一种兼具再生丝素蛋白和重组人源化胶原蛋白的软组织再生填充剂，将是一款具有优越性能的组织工程和再生医学材料。

4、目前，通过吸附或共混复合生物活性分子是改善再生丝素蛋白生物活性低的常规方法，但也同时存在复合后材料的稳定性、均一性差，导致复合生物活性分子易解离，作用时间短的使用瓶颈。另外，通过化学修饰、交联虽然可以解决复合材料稳定性差的问题，但是额外引入的化学试剂和交联剂残留将引起材料使用的安全性隐患。近年来，基于氢键、亲疏水、静电吸附及反溶剂作用诱导分子共组装技术是一种制备功能性复合材料的新方法。特别地，反溶剂诱导分子组装技术是一种纯物理过程，具有效率高、成本低、放大生产容易等优势。

5、再生丝素蛋白在作为可注射软组织填充材料使用时，需要将其制备成可通过注射器注射的水凝胶或微粒，进而将其注入到目标组织，实现组织填充、修复的功效。再生丝素蛋白水凝胶，其内部分子结构分布都较为松散，导致其在植入机体组织后，极易被组织内各种蛋白酶快速分解，从而达不到长周期的组织填充效果。根据相关研究报道，再生丝素蛋白凝胶在植入大鼠皮下3个月后，其凝胶体积减少约50％左右。与再生丝素蛋白水凝胶相比较，再生丝素蛋白微粒具有较为致密且稳定的分子结构，其体内降解周期长达1年以上，因此，再生丝素蛋白微粒更适合作为软组织填充材料，应用于组织工程和再生医学领域的应用。目前，再生丝素蛋白微粒的制备方法主要包括乳液法、自组装法、离子凝聚法、相分离法和微制备法等。上述方法的共同特点是制备工艺复杂，制备效率低，不适合于工业化放大生产。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种可注射软组织再生填充剂及其制备方法。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种可注射软组织再生填充剂，其组成成分包括：10～50份再生丝素蛋白与重组iii型人源化胶原蛋白形成复合微粒支架、1份透明质酸钠和100份磷酸盐缓冲溶液。

4、优选地，所述可注射软组织再生填充剂，其组成成分包括：30份再生丝素蛋白与重组iii型人源化胶原蛋白形成复合微粒支架、1份透明质酸钠和100份磷酸盐缓冲溶液。

5、优选地，再生丝素蛋白与重组iii型人源化胶原蛋白形成复合微粒支架的制备方法为：

6、1)制备再生丝素蛋白；

7、2)将再生丝素蛋白和重组iii型人源化胶原蛋白加入到注射水中，搅拌至全部溶解；

8、3)将再生丝素蛋白-重组iii型人源化胶原蛋白复合溶液放入冷冻干燥箱，冷冻干燥得到再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合海绵；

9、4)将冷冻干燥后的再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合海绵中加入醇中孵化，然后用注射水洗涤海绵，除掉醇，得到不可溶性再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合海绵；

10、5)将不可溶性再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合海绵通过粉碎方法及钴60辐照灭菌工艺制备成无菌再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合微粒支架。

11、优选地，所述步骤2)中，再生丝素蛋白、重组iii型人源化胶原蛋白与注射水的质量比为3:1.5:30。

12、优选地，在所述步骤4)中，所述醇为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种，优选为乙醇；所述醇孵化的时间为1-24h，优选为2h；

13、优选地，在所述步骤5)中，所述粉碎方法为机械粉碎、气流粉碎和球磨粉碎中的一种；机械粉碎的搅拌速度为5000-20000rpm，优选为20000rpm；粉碎方法为球磨粉碎的速度为400-800rpm，优选为600rpm；

14、优选地，在所述步骤5)中，所述60辐照灭菌的辐照剂量为8-25kgy，优选为15kgy；

15、优选地，在所述步骤5)中，所述再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合微粒支架的平均粒径尺寸d50为10-120μm，优选为20-60μm。

16、本发明还提供了所述可注射软组织再生填充剂的制备方法，包括：

17、a)将透明质酸钠加入到磷酸盐缓冲溶液中，并搅拌至完全溶解；

18、b)将再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合微粒支架加入到透明质酸钠磷酸盐缓冲溶液中，搅拌混合均匀后灌装至预灌封注射器，制备成可注射软组织再生填充剂。

19、优选地，在所述步骤a)中，所述透明质酸钠的分子量范围为500-1000kda。

20、优选地，在所述步骤a)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mm。

21、本发明所述的可注射软组织再生填充剂在制备组织工程或再生医学材料中的应用。

22、本发明的有益效果：根据本发明实施例的方案，通过反溶剂诱导分子共组装技术，并结合机械粉碎、气流粉碎、球磨粉碎技术，制备出再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合微粒支架。进一步，将微粒支架与透明质酸钠凝胶等辅料复配后，制备成一种可注射的软组织再生填充剂。再生丝素蛋白是一种具有优良生物相容性和生物降解性的天然生物高分子材料，由18种氨基酸组成，其中多种为人体细所需的氨基酸，具有加速细胞新陈代谢，延缓皮肤衰老的功效。重组人源化胶原蛋白是利用基因工程和合成生物学技术开发的具有与人源胶原蛋白高度相似氨基酸序列的一种蛋白质分子。与天然提取的动物源胶原蛋白相比较，重组人源化胶原蛋白相较于传统的动物源胶原蛋白具有多方面的优势。在生物相容性方面，重组人源化胶原蛋白的结构与人自身产生的胶原蛋白高度相似，因此具有更好的生物相容性，减少了人体排异反应的风险；生物安全性方面，由于是通过基因工程技术生产的，避免了从动物体内提取胶原蛋白可能带来的病毒隐患和病原体残留问题，提高了产品的安全性；重组胶原蛋白还具有低免疫原性，由于重组人源化胶原蛋白的生产过程可以控制胶原蛋白的结构和序列，从而降低了免疫原性，减少了过敏反应的可能性；另外，重组人源化胶原蛋白还具有产品纯度高、稳定性好、易于加工存储和可规模化生产等一系列优势。因此，重组人源化胶原蛋白在医疗、美容、护肤等多个领域都有广泛的应用潜力，如用于创面修复、组织填充等。进一步，如果运用创新技术将再生丝素蛋白和重组人源化胶原蛋白复合，制备成一种兼具再生丝素蛋白和重组人源化胶原蛋白的软组织再生填充剂，将是一款具有优越性能的组织工程和再生医学材料。

23、本发明中制备的再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合微粒支架的分子结构致密且稳定，体内降解周期长。同时，与重组人源化胶原蛋白复合后，可以有效提高再生丝素蛋白的生物活性，有助于促进细胞的黏附、增殖、分化，并促进新组织再生。特别地，反溶剂诱导分子共组装技术具有效率高、成本低、放大生产容易等优势。

24、进一步地，选用机械粉碎、气流粉碎、球磨粉碎的不同方法制备复合微粒，可通过控制方法中的工艺条件，有效调控微粒的平均粒径，并可实现大范围量产。

25、此外，通过将上述方法制备获得的再生丝素蛋白-重组人源化胶原蛋白复合微粒支架与透明质酸钠等辅料复配后制备成的可注射软组织再生填充剂在作为组织工程和再生医学材料使用中不但具有填充效果突出，可塑性好的优势，同时，填充剂中的复合微粒支架还可以诱导组织的成纤维细胞和胶原蛋白再生，延长填充剂的效果维持时间，是一种具有创新性的组织工程和再生医学材料。