一种耐高温漆酶突变体及其制备与应用

本发明属于酶的基因工程，具体涉及一种耐高温漆酶突变体及其制备与应用。

背景技术：

1、木质纤维素秸秆是潜力巨大的可开发利用的生物质资源，秸秆的成分主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，木质素与半纤维素和纤维素的共价结合阻碍了木质素有效的降解，去除木质素是利用纤维素和半纤维素的前置条件。目前工业领域应用在去除木质素的工艺是纤维素利用的强碱高温制浆技术、半纤维素利用的强酸高温木糖（或糠醛）技术，这些工艺均存在环境污染带来的禁止或限制发展问题。

2、生物酶法替代强酸、强碱工艺降解木质素是解决污染、增加效益最有效的手段。然而，由于木质纤维素秸秆组成成分之间化学键的复杂性，利用具有专一属性单一酶降解木质素存在巨大的障碍。采用利用不同功能的酶复配为复合酶在同一场景下联合作用使木质素降解成为可能，具有特定功能属性的木质素降解酶，如漆酶，它的自然酶学属性无法满足作为复合酶中特定场景应用的条件（如：温度、ph、酶活等）下发挥作用，需要通过漆酶突变体及其基因、工程菌和制备来实现这一目标。

3、漆酶，属于蓝色多铜氧化酶（mcos）家族，是mcos的最大亚家族，广泛分布于多种生物中，具有多种功能。漆酶通常包含四个铜原子，一个 t1cu，一个t2cu和两个t3cu。漆酶能够催化酚类化合物及其衍生物的单电子氧化，形成相应的反应性自由基或苯醌中间体，o2为最终电子受体，产生的h2o为唯一的副产物，同时自由基中间体在漆酶的催化中心外自发地相互偶联产生低聚物和聚合物。漆酶在木质素降解中的氧化作用导致残余木质素结构中甲基含量的降低、共轭羰基的增加、羰基和酯基增，提高了木质素的可降解性和可利用性。这表明漆酶在体内和体外都可以作为一种环境友好、用途广泛的“绿色催化剂”。因此漆酶在工业领域具有广泛的应用。

4、漆酶是一种普遍存在的酶，它广泛分布于自然界中，通常由植物、昆虫、真菌和细菌产生。漆树来源的漆酶是对漆酶研究的开始。漆酶能够以植物中的松柏醇等为底物，反应产生木质素。还可以使木质素彻底降解。此外，漆酶参与植物的保护作用以及病原菌的侵入。昆虫来源的漆酶研究较少。目前，发现有漆酶活性的昆虫有麻蝇、烟草天蛾、绿头苍蝇、蚊子和蝗虫等。真菌来源漆酶因白腐真菌漆酶能够降解木质素而成为了研究的热点。直至现在对真菌来源漆酶的研究仍未停止，比如 pleurotus pulmonarius、 tricholoma  giganteum来源的漆酶。在细菌中发现漆酶的时间较真菌漆酶要晚，早先报道的漆酶细菌来源有 bacillus sphaericus、 azospirllum lipoferum和 alteromonas。目前围绕细菌漆酶，主要研究的是芽孢杆菌属来源漆酶。大部分真菌来源漆酶在高温、高碱等条件下不稳定，大多数金属离子以及抑制剂对真菌漆酶具有明显的抑制作用。相较于真菌漆酶，细菌漆酶能够在高温、较宽 ph 范围内和高盐浓度下发挥作用，与其他细菌漆酶相比，芽孢杆菌漆酶有更优异的耐碱性和热稳定性且受金属离子的影响较小。在秸秆的工业降解过程中，往往需要高温辅助。因此在野生型芽孢杆菌漆酶基础上进一步提其稳定性，有利于其在工业上的应用。

5、因此，本发明中，通过对来源于解淀粉芽孢杆菌（ bacillus amyloliquefaciens）的漆酶基因进行突变，筛选得到热稳定性提高的漆酶突变体基因。随后利用芽孢杆菌和毕赤酵母表达系统，表达制备了耐高温突变体漆酶。

技术实现思路

1、基于漆酶高温应用场景的问题，为了获得热稳定性提升的漆酶，需对其现有性质作进一步改造，本发明的目的在于提供一种耐高温的漆酶突变体。将解淀粉芽孢杆菌（ bacillus amyloliquefaciens）来源的漆酶基因（ lac）在大肠杆菌bl21中进行表达；利用易错pcr技术对基因 lac突变，并利用abts对突变体进行筛选，选出热稳定性提高的突变体，实现了在枯草芽孢杆菌wb600、解淀粉芽孢杆菌cgmcc no.11218、毕赤酵母 gs115中表达制备。

2、实现本发明目的的技术路线概述如下：

3、对来自解淀粉芽孢杆菌（ bacillus amyloliquefaciens）的漆酶基因lac进行突变，利用大肠杆菌表达系统筛选得突变体t262f/t387l及编码基因 lacm1，在80 ℃下的半衰期提高到野生型漆酶（lac）的172%。利用枯草芽孢杆菌wb600、解淀粉芽孢杆菌cgmccno.11218、毕赤酵母 gs115实现了最优突变体漆酶t262f/t387l的高效制备。

4、本发明提供的技术方案之一，是一种漆酶突变体，所述突变体是在seq id no.1所示野生型漆酶基础上，发生包含t262f和t387l的突变获得的，命名为t262f/t387l突变体；

5、进一步地，所述t262f/t387l突变体，氨基酸序列如seq id no.3所示；

6、更进一步地，所述t262f/t387l突变体的编码基因 lacm1，核苷酸序列如seq idno.4所示。

7、本发明提供的技术方案之二，是包含上述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株；

8、进一步地，采用的表达载体为pet-28a(+)，宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，或者毕赤酵母；

9、更进一步地，宿主细胞为大肠杆菌bl21；

10、更进一步地，宿主细胞为枯草芽孢杆菌wb600，或者宿主细胞为解淀粉芽孢杆菌cgmcc no.11218，或者宿主细胞为毕赤酵母 gs115；

11、优选地，所述重组菌株是将突变体编码基因与表达载体pet-28a(+) 连接后在宿主大肠杆菌中表达所得。

12、本发明提供的技术方案之三，是上述重组质粒或重组菌株在生产技术发方案一所述漆酶突变体中的应用。

13、本发明提供的技术方案之四，是技术方案一所述漆酶突变体的应用，特别是在降解木质纤维素中的应用；

14、进一步地，是在降解秸秆或甘蔗渣中的应用；

15、更进一步的，是在降解玉米秸秆、水稻秸秆或小麦秸秆中的应用。

16、在本发明中采用如下定义：

17、1.氨基酸和dna核酸序列的命名法

18、使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用单字母或三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。

19、2. 漆酶突变体的标识

20、采用“原始氨基酸+位置+替换的氨基酸”来表示lac突变体中突变的氨基酸。如t262f，表示位置262的氨基酸由野生型lac的thr替换成phe，位置的编号对应于seq idno.1中野生型lac成熟肽的氨基酸序列编号。

21、在本发明中，lac代表野生型漆酶，t262f/t387l代表漆酶突变体，小写斜体 lac表示野生型漆酶lac的编码基因，小写斜体 lacm1表示突变体t262f/t387l的编码基因，具体信息如下表。

22、

23、有益效果

24、本发明利用易错pcr技术对lac野生型进行突变，得到80℃下热稳定性相对于野生型提高的突变体t262f/t387l，在80 ℃下的半衰期提高到野生型漆酶（lac）的172%。