一种检测黄曲霉毒素B1（AFB1）的电化学适配体传感器及其制备方法

本发明涉及生物传感器，具体涉及一种检测黄曲霉毒素b1（afb1）的电化学适配体传感器及其制备方法。

背景技术：

1、在食物和饲料的生产、加工和储存过程中，真菌的污染是一个不容忽视的问题。当这些真菌生长和繁殖时，它们会产生一系列的有毒代谢产物，这些物质被统称为霉菌毒素。这些毒素对人类和动物的健康构成了严重威胁，可能导致一系列疾病和健康问题。在众多已知的霉菌毒素中，有几种特别常见且危害性较大的类型，包括黄曲霉毒素（aft）、玉米赤霉烯酮（zen）、赭曲霉毒素（ot）和伏马菌素（fb）。这些毒素由不同的真菌产生，并在不同的环境和条件下积累。

2、黄曲霉毒素b1（afb1）是黄曲霉毒素家族中的一员，也是其中最为人们所熟知的一种。afb1不仅分布广泛，而且其储量相对较大，即使在极低的浓度水平下，afb1也能产生明显的毒性效应。因此，对食品和饲料中afb1的检测变得尤为重要。在众多的检测方法中，基于电化学适配体（e-ab）的传感器技术因其高灵敏度、快速响应和操作简便等优点而受到广泛关注。为了提高传感器的检测性能，通常会对电极表面修饰策略以及信号放大技术进行研究，从而提高检测的灵敏度和准确性。

3、本发明的目的在于提供一种能克服上述问题以及易制备、操作简单、灵敏度高、抗干扰性强、重现性、选择性及稳定性好的适配体传感器，构建的电化学生物传感器在afb1存在的情况下，与适配体结合使适配体发生构象变化，导致修饰有mb的一端更靠近电极，使得电信号增大，并通过添加cdna-paa纳米复合材料放大电化学信号的差值，通过对比添加afb1前后电信号的变化达到检测的目的。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种检测afb1的电化学适配体传感器及其制备方法，基于适配体发生构象变化前后在不同电位下产生可区分的dpv峰来构建适配体传感器，以提供一种易制备、操作简单、灵敏度高、抗干扰性强、重现性、选择性及稳定性好的电化学适配体传感器。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种检测afb1的适配体传感器，包含afb1适配体和玻碳电极，所述afb1适配体采用亚甲基蓝、巯基进行标记形成适配体功能化探针（apt-mb），所述玻碳电极的表面引入碳化钛薄层分散液、纳米金与互补链-聚丙烯酸纳米凝胶材料，标记后的适配体功能化探针通过金硫键固定于纳米金上。

4、检测afb1的适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：

5、(1) 巯基修饰适配体的还原：将15µm的巯基修饰的afb1适配体与1m的tcep混合，室温下还原30min，将带有二硫键的巯基还原；

6、(2) 玻碳电极表面处理：采用铝粉抛光玻碳电极后用超纯水清洗，然后分别在超纯水和无水乙醇中进行超声处理，再用氮气干燥，将处理过的电极放置在ph 7的kcl、[fe(cn)6]3-/4- 混合溶液中，使用循环伏安法测试电极的预处理效果，扫描范围：-0.2-0.7v；扫描速度：100mv/s，预处理gce的cv曲线的峰值电位差低于100mv，进行下一步处理，将7μl的ti3c2tx（mxene）滴加在电极表面并在27℃下放置2h；

7、(3) 通过金硫键将适配体组装在电极表面：将6µl的aunps滴加到ti3c2tx（mxene）/gce表面，并在27℃下放置2h，然后滴加6µl适配体，并于27～30℃下孵育2～4h，然后在电极表面滴加6μl的mch以封闭非特异性结合位点；

8、（4） 将cdna-paa纳米凝胶复合材料组装在电极表面：将6µl的cdna-paa纳米凝胶复合材料滴加到mch/apt-mb/ti3c2tx（mxene）/gce表面，并在27℃下放置2h即可获得适配体传感器。

9、更优地，所述巯基修饰适配体的还原中，适配体与tcep的体积比为：40:1。

10、更优地，所述纳米金分散液的制备过程为：将1ml浓度为1％的氯金酸和99ml的超纯水混合后搅拌，放在加热炉上加热至沸腾，保持搅拌状态下加入2.5ml浓度为1％的柠檬酸钠，继续加热10min-15min，直至溶液由灰色变为稳定的酒红色，自然搅拌冷却至室温后离心洗涤，最后恢复至原体积，即可得到纳米金分散液。

11、更优地，所述kcl、[fe(cn)6]3-/4-混合溶液中，kcl的浓度为0.1m，[fe(cn)6]3-/4-的浓度为5mm。

12、更优地，首先制备一个包含55 ml h2o、50 mg sds 60 mg过硫酸铵的混合溶液，并将其迅速搅拌10 min以确保各成分充分混合。随后，向此溶液中加入50 mg mba和1 ml aa，并将混合溶液置于80℃的水浴中进行聚合反应。在80℃条件下持续反应四小时后，成功制备出了paa纳米凝胶。接着，经过两次离心除去未反应的化学物质后，将paa纳米凝胶重新分散到11 ml的水中，以备后续使用。接下来，为了激活paa纳米凝胶中的羧基，以便与cdna的氨基连接，将2 ml新鲜制备的edc和nhs（0.2 m）注入到2 ml的paa纳米凝胶中，并在37℃静置1小时。之后，对paa纳米凝胶进行一次离心操作并用2 ml的pbs溶液洗涤。随后，向其中加入10 μl浓度为100 μm的cdna，并将混合物在37℃静置两小时，得到cdna-paa纳米复合材料。

13、综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

14、1、本发明运用亚甲基蓝(mb)和巯基(hs-sh)标记afb1适配体，利用电活性物质mb在适配体折叠前后在不同电位下产生的不同的dpv峰，利用巯基通过金硫键与纳米金相连将适配体固定，而构建用于检测afb1适配体传感器；在电极表面引入碳化钛(ti3c2tx（mxene）)纳米材料，增强了工作电极的生物相容性，比表面积和导电性能，从而增加适配体功能化探针在工作电极表面的固定量，为适配体与靶标物的结合提供生物相容性良好的界面，同时良好的导电性能进一步增强了适配体与靶标物结合时产生的电流变化；加入自制的聚丙烯酸（paa）纳米凝胶形成cdna-paa纳米凝胶复合材料可实现协同放大电化学信号的差值从而使得本申请提出的适配体传感器对afb1具有较良好的灵敏性、稳定性、重现性和抗干扰性，afb1的最低检出限也达到了0.0003ng/l；

15、2、本发明可应用于花生实际样品中afb1的检测，加标回收率良好；

16、3、本发明所属传感器构建方法通过更换不同的识别元件(其他种类适配体)，可用于其他不同种类真菌毒素的检测，从而更大范围内推广此类检测技术及应用，为快速、灵敏地检测多种真菌毒素提供技术支撑。

技术特征：

1.一种检测黄曲霉毒素b1(afb1)的电化学适配体传感器，其特征在于：包含afb1适配体以及玻碳电极，所述afb1适配体采用亚甲基蓝、巯基进行标记形成适配体功能化探针（apt-mb），所述玻碳电极的表面引入碳化钛薄层分散液、纳米金与互补链-聚丙烯酸纳米凝胶材料，标记后的适配体功能化探针通过金硫键固定于纳米金上。

2.一种如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素b1(afb1)的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的检测afb1的适配体传感器的制备方法，其特征在于：所述巯基修饰适配体的还原中，适配体与tcep的体积比为：40:1。

4.如权利要求2所述的检测afb1的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述纳米金分散液的制备过程为：将1ml浓度为1％的氯金酸和99ml的超纯水混合后搅拌，放在加热炉上加热至沸腾，保持搅拌状态下加入2.5ml浓度为1％的柠檬酸钠，继续加热10min-15min，直至溶液由灰色变为稳定的酒红色，自然搅拌冷却至室温后离心洗涤，最后恢复至原体积，即可得到纳米金分散液。

5.如权利要求2所述的检测afb1的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述kcl、[fe(cn)6]3-/4-混合溶液中，kcl的浓度为0.1m，[fe(cn)6]3-/4-的浓度为5mm。

6.如权利要求2所述的检测afb1的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述cdna-paa纳米凝胶复合材料的制备过程为：首先制备一个包含55 ml h2o、50 mg sds 60 mg过硫酸铵的混合溶液，并将其迅速搅拌10 min以确保各成分充分混合。随后，向此溶液中加入50mg mba和1 ml aa，并将混合溶液置于80℃的水浴中进行聚合反应。在80℃条件下持续反应四小时后，成功制备出了paa纳米凝胶。接着，经过两次离心除去未反应的化学物质后，将paa纳米凝胶重新分散到11 ml的水中，以备后续使用。接下来，为了激活paa纳米凝胶中的羧基，以便与cdna的氨基连接，将2 ml新鲜制备的edc和nhs（0.2 m）注入到2 ml的paa纳米凝胶中，并在37℃静置1小时。之后，对paa纳米凝胶进行一次离心操作并用2 ml的pbs溶液洗涤。随后，向其中加入10 μl浓度为100 μm的cdna，并将混合物在37℃静置两小时，得到cdna-paa纳米复合材料。

技术总结本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的电化学适配体传感器及其制备方法，涉及生物传感器技术领域；引入碳化钛薄层分散液（Ti3C2Tx（MXene））纳米材料与纳米金(AuNPs)提高工作电极的生物相容性、比表面积和导电性能，自制聚丙烯酸（PAA）纳米凝胶并添加适配体互补链（cDNA）形成cDNA‑PAA纳米凝胶复合材料，实现协同放大添加靶标前后的电化学信号差值，分别使用亚甲基蓝（MB）和巯基(HS‑SH)标记AFB1适配体，适配体识别靶标前后可在差分脉冲伏安法(DPV)不同电位下产生可区分的电流峰以实现对AFB1的检测；构建的传感器具有较好的重现性、抗干扰性和稳定性，在实际样品检测中获得了满意的回收率。技术研发人员：赵文苹,孟晓娅,桑茂盛,李忠钰,周全龙,张恒,韩阳,孙霞,郭业民受保护的技术使用者：山东理工大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29