一种表达铜绿假单胞菌外膜蛋白I的重组乳酸乳球菌、质粒和疫苗及其应用

本发明属于微生物，具体涉及pmg36c-opri质粒和表达铜绿假单胞菌外膜蛋白i的重组乳酸乳球菌应用于制备防治铜绿假单胞菌感染的疫苗。

背景技术：

1、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，pa)又称绿脓杆菌，属假单胞菌属，广泛分布于自然界以及正常人的皮肤上、呼吸道和肠道中，是医院和养殖业常见的致病菌。当机体免疫功能受损或缺失时，可引起宿主急性或慢性感染，导致菌血症、败血症等疾病的发生，危害机体生命和健康。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者以及术后或某些治疗后的患者易感染此菌，可引起术后伤口感染、褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等，铜绿假单胞菌已成为医院内感染的重要病原菌之一，对人体健康和养殖业造成了较大的危害和经济损失。同时，该菌抗生素耐药情况日益严重，导致抗生素疗效不佳。疫苗的应用不受限于细菌的耐药机制，并且具有特异性，可避免长期使用抗生素而导致的菌群失调现象，所以急需一种疫苗来防治铜绿假单胞菌的感染。

2、铜绿假单胞菌的外膜蛋白(outer membrane protein,omp)opri是一种无毒性、无致热原的抗原，具有良好的免疫原性，同时，不同血清型铜绿假单胞菌菌株的外膜蛋白可发生交叉免疫反应，使其成为疫苗研制的候选分子。而且，opri蛋白能激活toll样受体(toll-like receptor，lr)，进而启动固有免疫应答发挥免疫佐剂的作用，刺激机体产生多种类型的免疫应答，因此opri蛋白是一种有希望的疫苗分子，在pa疫苗的研究方面具有重要价值。

3、近年来，基因工程载体疫苗成为了众多研究者的研发热点和主攻方向。研究人员发现新型疫苗载体如两歧双歧杆菌(bifidobacerium bifidum)、乳球菌(lactococctw)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)等具有容易制备、可口服接种、可诱导肠道粘膜免疫、安全性高等优点。其中，乳酸乳球菌是乳酸菌的重要模式菌，广泛存在于乳制品和植物产品中，在食品工业中应用广泛，对人和动物无致病性，被公认为安全的(generally regardsas safe，gras)食品级微生物。近年来，乳酸乳球菌分子生物学及作用机制的研究取得了重大发展，一系列具有不同用途的乳酸乳球菌基因表达系统已逐步建立，并成功地表达了许多抗原蛋白、细胞因子和生物酶等。但是目前还未有报道使用乳酸乳球菌mg1363表达铜绿假单胞菌外膜蛋白i。

技术实现思路

1、针对铜绿假单胞菌对抗生素耐药情况日益严重，导致抗生素疗效不佳，本发明提供了一种含有表达铜绿假单胞菌外膜蛋白i的重组乳酸乳球菌的疫苗，解决了铜绿假单胞菌对抗生素耐药性的问题，该疫苗有利于预防铜绿假单胞菌感染。

2、本发明的目的之一在于，一种质粒pmg36c-opri包含铜绿假单胞菌的外膜蛋白i的氨基酸序列和载体pmg36c。

3、优选地，铜绿假单胞菌的外膜蛋白i的氨基酸序列如seq1。

4、本发明的目的之二在于一种重组乳酸乳球菌包含上述质粒pmg36c-opri。

5、优选地，重组乳酸乳球菌表达铜绿假单胞菌外膜蛋白i。

6、优选地，菌株的宿主为mg1363。

7、本发明的目的之三在于一种疫苗采用上述的质粒pmg36c-opri或上述的重组乳酸乳球菌制备获得。

8、本发明的目的之四在于，上述质粒pmg36c-opri在制备预防铜绿假单胞菌感染疫苗中的应用。

9、优选地，铜绿假单胞菌为i型血清型菌株、iii型血清型菌株、v型血清型菌株或vii型血清型菌株。

10、本发明的目的之五在于，上述重组乳酸乳球菌应在制备预防铜绿假单胞菌感染疫苗中的应用。

11、优选地，铜绿假单胞菌为i型血清型菌株、iii型血清型菌株、v型血清型菌株或vii型血清型菌株。

12、有益效果

13、1、采用乳酸乳球菌作为表达载体的有益效果包括：首先，乳酸乳球菌不定居肠道，免疫原性小，不会造成持续刺激机体免疫系统等弊端，可重复使用；其次，乳酸乳球菌携多种免疫辅助成分起到免疫修饰作用，可作为佐剂激活宿主免疫系统，促进细胞分裂、体液及细胞免疫；第三，乳酸乳球菌分泌蛋白少，不分泌胞外蛋白酶，表达的外源分泌蛋白易被检测且不易发生胞外降解；最后，乳酸乳球菌易于驯化。

14、2、首次使用乳酸乳球菌表达铜绿假单胞菌外膜蛋白opri，为预防和治疗铜绿假单胞菌感染提供新的思路。

15、3、表达铜绿假单胞菌外膜蛋白i的重组乳酸乳球菌能够保护小鼠预防i型血清型菌株、iii型血清型菌株、v型血清型菌株或vii型血清型菌株的攻击，有利于铜绿假单胞菌感染的预防，并且保护率较高，均在70％以上。

16、4、制备一种预防铜绿假单胞菌感染的疫苗，可以代替传统使用抗生素的方法，解决了抗生素疗效不佳的问题。

技术特征：

1.一种质粒pmg36c-opri，其特征在于：所述质粒pmg36c-opri包含铜绿假单胞菌的外膜蛋白i的氨基酸序列和载体pmg36c。

2.根据权利要求1所述的一种质粒pmg36c-opri，其特征在于：所述铜绿假单胞菌的外膜蛋白i的氨基酸序列如seq1。

3.一种重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述菌株包含权利要求1所述的质粒pmg36c-opri。

4.根据权利要求3所述的一种重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述重组乳酸乳球菌表达铜绿假单胞菌外膜蛋白i。

5.根据权利要求3所述的一种重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述菌株的宿主为mg1363。

6.一种疫苗，其特征在于：所述疫苗采用权利要求1所述的质粒pmg36c-opri或权利要求3所述的重组乳酸乳球菌制备获得。

7.权利要求1所述的质粒pmg36c-opri在制备预防铜绿假单胞菌感染疫苗中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述铜绿假单胞菌为i型血清型菌株、iii型血清型菌株、v型血清型菌株或vii型血清型菌株。

9.权利要求3所述的重组乳酸乳球菌应在制备预防铜绿假单胞菌感染疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述铜绿假单胞菌是i型血清型菌株、iii型血清型菌株、v型血清型菌株或vii型血清型菌株。

技术总结本发明提出了一种表达铜绿假单胞菌外膜蛋白I的重组乳酸乳球菌、质粒和疫苗及其应用，属于微生物技术领域领域。解决了对铜绿假单胞菌感染的危害和抗生素耐药等问题。本发明的目的在于提供一株表达铜绿假单胞菌外膜蛋白I的重组乳酸乳球菌和质粒pMG36c‑OprI能够保护小鼠抵抗4种血清型铜绿假单胞菌临床菌株的攻击，并应用于制备防治铜绿假单胞菌感染的疫苗。技术研发人员：曲晓军,张云志,于德水,甄涛,张淑梅,张艳琪,张严,叶阳,张婉婕,张建伟,张诗萌,姜威受保护的技术使用者：黑龙江省科学院微生物研究所技术研发日：技术公布日：2024/9/29