一种检测氧乐果的试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明涉及氧乐果的检测，具体涉及一种用于检测氧乐果的胶体金试纸条，其特别适用于果蔬中氧乐果残留的检测。

背景技术：

1、氧乐果又名氧化乐果，为高效、高毒、广谱性杀虫、杀螨剂，具有较强的内吸、触杀和胃毒作用，用于防治棉蚜、棉叶蝉、稻飞虱、稻叶蝉、稻蓟马、橘蚜、红蜘蛛、柑橘粉虱、木虱、红蜡蚧等。氧乐果属于高毒有机磷农药，在我国已被禁止用于果蔬生产上，但有些地方还是会违反规定，在水、土壤、水果、蔬菜中时常会检测到氧乐果残留，对人体健康构成了严重的威胁。gb 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了氧乐果在蔬菜、水果中最大残留限量为0.02mg/kg，因此需要建立高效、灵敏、准确的果蔬中氧乐果检测分析方法。

2、目前已报道的检测氧乐果的方法主要是气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适于果蔬中氧乐果残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有的检测氧乐果的方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的特点，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的试纸条及其制备方法和应用，以实现对大批量的样品进行快速检测。

2、为了实现本发明的目的，本发明提供了一种检测氧乐果的试纸条，包括试纸和微孔试剂；所述试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫，其依次连接，所述反应膜上具有包被有氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述微孔试剂上冻干有氧乐果单克隆抗体-胶体金标记物，其具有微孔塞。

3、所述氧乐果单克隆抗体是以氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

4、所述氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物由氧乐果半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；

5、所述氧乐果半抗原的合成方法为：取氧乐果2.13g，加吡啶80ml溶解，氮气保护下，滴加含有1.08g丙烯酰氯的吡啶溶液5ml，60℃反应4h，停止反应，旋蒸，除去吡啶，加甲苯溶解，旋蒸，以此除尽吡啶，得到黄色油状物，上硅胶柱，用体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱分离，得到氧乐果半抗原，其分子结构式为：

6、

7、所述底板为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫为聚酯纤维或玻璃纤维材质；所述吸水垫为吸水滤纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

8、本发明还提供了一种制备上述试纸条的方法，其包括以下步骤：

9、1)制备冻干有氧乐果单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

10、2)制备具有包被有氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

11、3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；

12、4)将1)和3)制备好的冻干有氧乐果单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

13、具体地说，步骤包括：

14、1)氧乐果与丙烯酰氯在吡啶催化下进行酯化反应，制备氧乐果半抗原；

15、2)将氧乐果半抗原与载体蛋白偶联，制备氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物；

16、3)用氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌氧乐果单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

17、4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

18、5)分别将氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(t)和质控线(c)上；

19、6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

20、7)将制备的氧乐果单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到氧乐果单克隆抗体-胶体金标记物；

21、8)将氧乐果单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

22、9)将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、ph为7.2的0.2mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；

23、10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫，最后切成3.95mm宽的小条，加塑料盒，真空包装；

24、11)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2～8℃条件下保存12个月。

25、本发明还提供了一种应用上述试纸条检测果蔬中氧乐果残留的方法，它包括以下步骤：

26、(1)样品前处理；

27、(2)用试纸条进行检测；

28、(3)分析检测结果。

29、本发明的氧乐果快速检测试纸条采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术，将氧乐果单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，样品中的氧乐果先与其充分反应，形成药物-抗体-胶体金标记物；再滴入试纸条卡孔内，样本中的药物在流动过程中与反应膜检测线上的氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合氧乐果单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有氧乐果残留。

30、检测时，样品经处理后滴入微孔试剂内，充分反应后再加入试纸条卡孔内，当氧乐果在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致；如果氧乐果在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与氧乐果全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比c线显色浅。如图5所示。

31、阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。

32、阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。

33、无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

34、本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的氧乐果单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测氧乐果的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

技术特征：

1.一种检测氧乐果的试纸条，包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述微孔试剂上冻干有氧乐果单克隆抗体-胶体金标记物；所述氧乐果单克隆抗体是以氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述氧乐果半抗原-载体蛋白偶联物由氧乐果半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；其特征在于，所述氧乐果半抗原的合成方法为：

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次黏贴在底板上组成，所述微孔试剂上具有微孔塞。

3.一种制备权利要求1-2任一项所述试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.一种应用权利要求1-2任一项所述试纸条检测果蔬中氧乐果残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种检测氧乐果的试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有氧乐果半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述微孔试剂上冻干有氧乐果单克隆抗体‑胶体金标记物。本发明还提供一种应用上述试纸条检测果蔬中氧乐果残留的方法。本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的优点，能够实现对大批量的样品进行现场快速检测。技术研发人员：万宇平,朱亮亮,田洪芸,张坤,刘玉梅受保护的技术使用者：北京勤邦科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29