启动子及其在构建产麦角甾醇的酵母菌株中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，尤其涉及启动子及其在构建产麦角甾醇的酵母菌株中的应用。

背景技术：

1、启动子（promoters）是dna分子上一段特定的核苷酸序列，它位于结构基因5'端上游的dna序列，能活化rna聚合酶，使之与模板dna准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子通过与特定的转录因子结合，形成转录复合物，进而启动rna聚合酶在dna模板上的移动，从而开始转录过程。在基因表达过程中，启动子起着至关重要的作用，它决定了基因转录的起始点，并影响着转录的效率。不同的基因可能具有不同的启动子序列，不同物种的同工酶的启动子序列也存在差异，这些序列的差异会导致基因表达的特异性和调控的复杂性。

2、酵母作为一种广泛使用的模式生物，在基因表达与产物收获方面展现了巨大的潜力。其优点在于生长迅速、易于培养，并且具有相对简单的基因组结构，这使得酵母成为基因工程的理想宿主。通过基因工程技术，科学家可以将目的基因插入酵母的基因组中，实现外源基因的高效表达。同时，酵母细胞内的代谢途径清晰，可以通过代谢工程进一步优化基因表达过程，提高目标产物的产量和纯度。此外，酵母细胞还能对特定的环境条件作出响应，如通过调整温度、ph值或添加诱导剂等方式，触发特定基因的表达，从而实现对产物表达的精确控制。

3、目前，酵母作为一种模式生物，在基因表达与产物收获领域具有广泛的应用前景。然而，传统的酵母启动子在实际应用中往往会遇到表达效率不足或产物产量较低的问题。为了解决这一难题，研究者们开始对酵母启动子进行优化。启动子优化的方法包括改变启动子序列的碱基组成、增加或删除特定的转录因子结合位点、调整启动子与基因之间的距离等。通过这些策略，研究者们可以有效地提高启动子的转录活性，从而增加目的基因的表达效率，进一步提升产物的产量。当前，针对酿酒酵母的启动子尚有较大的优化空间。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供启动子及其在构建产麦角甾醇的酵母菌株中的应用，以期提高酿酒酵母工程菌株的次生代谢产物的产量，特别是麦角甾醇的产量。

2、本发明提供的启动子包括片段a和片段b；

3、所述片段a具有如seq id no:1所示的核酸序列；

4、所述片段b具有如seq id no:2~9至少一项所示的核酸序列。

5、本发明对酵母菌，特别是酿酒酵母的启动子进行改造，在野生型启动子（seq idno:1所示）的基础上添加另一启动子形成启动子。本发明对片段a和片段b的连接关系不做限定，例如，片段a可在n端也可以在n端。

6、一些实施例中，片段a位于启动子的n端。

7、一些实施例中，片段b为来源不同的启动子，与片段a连接形成的新的启动子的核酸序列如seq id no:10~17中任一项所示。或者具体在如前所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；或者与如前所述的核酸序列具有至少90%同一性。

8、实验表明，相对于野生型启动子而言，seq id no:10~17中任一项所示的启动子都能够提高麦角甾醇的产量，其中，seq id no:10、seq id no:11、seq id no:13或seq idno:14所示的启动子促进麦角甾醇产量的效果与野生型相比存在显著性差异（p<0.05）。其中，seq id no:11所示的启动子在提高麦角甾醇产量方面存在更显著的效果（p<0.01）。此外，相对于野生型启动子而言，本发明提供的启动子还能够降低杂质的占比，特别是seq idno:11所示的启动子，相对于野生型启动子能够极显著降低杂质的含量（p<0.001）。

9、本发明还提供了如前所述启动子在提高酵母基因表达水平中的应用。

10、本发明中，所述酵母为酿酒酵母、假丝酵母、球拟酵母、红酵母、耶氏酵母、汉逊酵母、毕赤酵母或克鲁维酵母。

11、进一步的，本发明还提供了表达单元，其包括如前所述的启动子和目的基因。

12、本发明中，所述目的基因为erg4基因、erg2基因或erg3基因。

13、作为可行性案例，所述表达单元中还包括终止子，所述终止子为终止子tadh1、终止子tpdc1或具有seq id no:18 所示核酸序列的终止子。

14、另一些可行案例中，所述表达单元中，还包括增强子、转座子或侧翼序列中的至少一种。

15、更进一步的，本发明还提供了一种质粒载体，其包括如前所述的启动子或包括如前所述的表达单元。

16、本发明中，所述质粒载体为穿梭载体，或酵母表达载体。本发明对此不做限定。作为举例，所述质粒载体的骨架为pscm-n20质粒和/或phcas9质粒。

17、更进一步的，本发明还提供了一种酵母工程菌，其包括如前所述的质粒载体，或基因组中整合有如前所述的启动子或包括如前所述的表达单元。

18、一些实施例中，本发明所述的酵母工程菌的底盘菌为cctcc no: m2016418，其erg4基因的启动子为如前所述的启动子。

19、更进一步的，本发明还提供了一种麦角甾醇的制备方法，其包括，培养如前所述的酵母工程菌，获得含有麦角甾醇的发酵产物。

20、本发明中，所述含有麦角甾醇的发酵产物是发酵后的菌液、经分离的上清液或湿酵母。本发明中，所述麦角甾醇的制备还包括将湿酵母与片碱、氯化钠和无水乙醇混合，经90℃处理8h后，用正已烷进行萃取，经洗涤、浓缩后结晶获得麦角甾醇。

21、本发明对酵母菌，特别是酿酒酵母的启动子进行改造，在野生型启动子（seq idno:1所示）的基础上添加另一启动子形成新的启动子。含有该启动子添加在erg4基因的起始位置上，构建获得的产麦角甾醇的酿酒酵母菌株，麦角甾醇含量可达3.0~3.3 mg/g dcw，产量提升150%左右；甾醇类杂质占比为6.675%，比野生型菌株杂质占比下降50%左右。

技术特征：

1.启动子，其核酸序列如seq id no:11所示。

2.权利要求1所述的启动子在提高酵母基因表达水平中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因为erg4基因，所述酵母为酿酒酵母。

4.表达单元，其包括权利要求1所述的启动子和目的基因。

5.根据权利要求4所述的表达单元，其特征在于，所述目的基因为erg4基因。

6.根据权利要求4或5所述的表达单元，其特征在于，所述表达单元中还包括终止子，所述终止子的核酸序列如seq id no:18所示。

7.质粒载体，其包括权利要求1所述的启动子或包括权利要求4~6任一项所述的表达单元。

8.酵母工程菌，其包括权利要求7所述的质粒载体，或基因组中整合有权利要求1所述的启动子或包括权利要求4~6任一项所述的表达单元。

9.根据权利要求8所述的酵母工程菌，其特征在于，其底盘菌为cctcc no: m2016418，其erg4基因的启动子为权利要求1所述的启动子。

10.麦角甾醇的制备方法，其包括，培养权利要求8或9所述的酵母工程菌，获得含有麦角甾醇的发酵产物。

技术总结本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及启动子及其在构建产麦角甾醇的酵母菌株中的应用。本发明对酵母菌，特别是酿酒酵母的启动子进行改造。含有该启动子添加在ERG4基因的起始位置上，构建获得的产麦角甾醇的酿酒酵母菌株，麦角甾醇含量可达3.0~3.3 mg/g DCW，产量提升150%左右；甾醇类杂质占比为6.675%，比野生型菌株杂质占比下降50%左右。技术研发人员：王雅嗣,覃先武,陈晖,张彦,顾小松,刘秀继,杨玉贤受保护的技术使用者：安琪酵母（滨州）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29