单拷贝的糜子基因及利用其检测糜子中外源基因插入拷贝数的方法

本发明属于生物，具体涉及一种单拷贝的糜子基因及利用其检测糜子中外源基因插入拷贝数的方法，尤其涉及一种能够检测糜子中外源基因插入拷贝数的单拷贝的糜子基因及利用数字pcr和荧光定量pcr检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的方法。

背景技术：

1、转基因植物是基因组中含有外源基因的植物。其中，外源基因整合进入受体植物基因组的拷贝数会影响外源目的基因在受体植株中的表达及其遗传稳定性。当外源基因以单低拷贝（1~2个）插入到受体的基因组时，一般能够稳定高效的表达，而当外源基因以多拷贝数整合到受体基因组时，可能会出现表达水平较低甚至基因沉默，从而无法得到表现目的性状的转基因植株。因此，研究人员在挑选转基因t0代株系时，往往会选择单低拷贝整合的转基因株系用于后续的研究。然而，要挑选出单低拷贝整合的转基因t0代株系，往往需要从几十甚至上百个转基因t0代株系中鉴定筛选。如果采用传统的插入拷贝数检测方法，则工作量大，耗时久且成本高。因此，简单、快速、高效、高通量的外源基因插入拷贝数的检测方法对转基因植物育种研究非常重要。

2、传统的检测转基因植株中外源基因插入拷贝数的方法为southern杂交，该方法特异性强、灵敏度高，其准确性已经得到了大家的普遍认可，但其对样品dna的量与纯度要求较高，且成本高，周期长，难以满足高通量外源基因插入拷贝数检测的需求。荧光定量pcr也常用于转基因植株中外源基因插入拷贝数的检测，可分为荧光染料法和探针法。探针法相比于染料法，能更精确地对低拷贝的目的dna片段进行定量分析，但探针价格较昂贵，成本高。染料法虽然相较于探针法精准度稍有降低，但在检测单低拷贝外源基因时的准确性也足以满足育种工作需求，其成本较低，更适宜高通量检测。目前，荧光定量pcr测定外源基因插入拷贝数已成功应用于转基因水稻和棉花等作物的拷贝数检测。数字pcr技术是在荧光定量pcr技术基础上的一次技术革新，其分析结果可直接得出dna分子的个数，对起始样品进行绝对定量。相比荧光pcr，数字pcr具有更好的测量独立性，且无需任何校准物，具有更高的灵敏度、特异性和准确性。研究表明，数字pcr能够简单而准确地测定水稻、柑橘、马铃薯、玉米、番茄和小麦中的外源基因插入拷贝数。

3、糜子（ panicum miliaceum l.）属禾本科黍属，起源于我国的黄河流域，是人类最早驯化成功的粮食作物之一，其抗旱性强、生育期短、药用价值高，是干旱、半干旱地区的重要作物。糜子中蛋白质含量约为13%，高于小麦、水稻和玉米，且富含多种氨基酸、维生素和矿物质，具有保健和药食同源的功能。糜子有粳糯之分，糯性称为黍子，主要分布在华北和东北地区，粳性称为糜子或稷，主要分布在西北地区。目前我国糜子育种既缺少关键性种质的发现、创制和利用，又缺乏现代生物育种的应用和指导，难以实现精准育种。近年来，基因工程技术的发展，为糜子的育种及品种改良提供了一种快速有效的途径。中国发明专利申请202111531566.3公开了一种黍属植物的遗传转化方法，其采用基因枪轰击法进行遗传转化，获得了转基因糜子。中国发明专利202311246503.2公开了一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，获得了多个转基因糜子株系。近几年来，随着糜子遗传转化技术的发展，越来越多的研究者开始以性状改良为目的，进行转基因糜子生物育种研究。为了从大量转基因糜子株系中快速筛选出单低拷贝插入整合的转基因糜子株系用于后续育种研究，亟需建立一种简单、快速、高效检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的方法，初步筛选单低拷贝的转基因糜子株系。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供的是一种单拷贝的糜子基因及利用其通过与数字pcr和荧光定量pcr技术结合检测糜子中外源基因插入拷贝数的方法。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种单拷贝的糜子基因，所述单拷贝的糜子基因为用于检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的 sd1基因，该基因为pm13g15420，来自于糜子chr_13染色体；

4、在检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的过程中，所述 sd1基因作为内参基因，检测 sd1基因的正向引物sd1-f序列如seq id no：1所示、反向引物sd1-r序列如seq id no：2所示。

5、进一步的，在检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的过程中，以 hyg筛选标记基因作为外源基因，检测 hyg筛选标记基因的正向引物hyg-f序列如seq id no：4所示、反向引物hyg-r序列如seq id no：5所示。

6、进一步的，在检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的过程中，转基因糜子中外源基因插入拷贝数的判断方法为：

7、外源基因与内参基因的拷贝数比值或者外源基因的相对拷贝数约为0.5时转基因糜子为单拷贝插入（即外源基因与内参基因的拷贝数比值或者外源基因的相对拷贝数为0.26~0.74时转基因糜子为单拷贝插入）；

8、外源基因与内参基因的拷贝数比值或者外源基因的相对拷贝数约为1时转基因糜子为双拷贝插入（即外源基因与内参基因的拷贝数比值或者外源基因的相对拷贝数为0.75~1.25时转基因糜子为双拷贝插入）；

9、外源基因与内参基因的拷贝数比值或者外源基因的相对拷贝数约为1.5时转基因糜子为三拷贝插入（即外源基因与内参基因的拷贝数比值或者外源基因的相对拷贝数为1.26~1.74时转基因糜子为三拷贝插入）；

10、以此类推转基因糜子的其它插入拷贝数，例如四拷贝插入、五拷贝插入等。

11、一种利用上述单拷贝的糜子基因检测糜子中外源基因插入拷贝数的方法，所述方法是以 sd1基因作为内参基因，以 hyg筛选标记基因作为外源基因，利用引物对sd1-f/sd1-r和引物对hyg-f/hyg-r，检测转基因糜子的基因组dna，并根据转基因糜子中外源基因与内参基因的拷贝数比值或者外源基因的相对拷贝数，判断转基因糜子中外源基因插入拷贝数。

12、进一步的，转基因糜子的基因组dna是采用数字pcr技术或荧光定量pcr技术进行检测。

13、进一步的，采用数字pcr技术检测过程中，转基因糜子中外源基因插入拷贝数的判断方法为：

14、由于糜子是异源四倍体，且内参基因在糜子基因组中为单拷贝，外源基因与内参基因的拷贝数比值约为0.5时转基因糜子为单拷贝插入（即外源基因与内参基因的拷贝数比值为0.26~0.74时转基因糜子为单拷贝插入）；

15、外源基因与内参基因的拷贝数比值约为1时转基因糜子为双拷贝插入（即外源基因与内参基因的拷贝数比值为0.75~1.25时转基因糜子为双拷贝插入）；

16、外源基因与内参基因的拷贝数比值约为1.5时转基因糜子为三拷贝插入（即外源基因与内参基因的拷贝数比值为1.26~1.74时转基因糜子为三拷贝插入）；

17、以此类推转基因糜子的其它插入拷贝数，例如四拷贝插入、五拷贝插入等。

18、进一步的，采用数字pcr技术检测过程中，利用基因 sd1作为内参基因的探针序列如seq id no：3所示，利用 hyg筛选标记基因作为外源基因的探针序列如seq id no：6所示。

19、进一步的，所述数字pcr技术是使用microdrop微滴式数字pcr系统进行数字pcr反应；

20、采用数字pcr技术检测过程中，以转基因糜子的基因组dna为dna模板，反应体系为：微滴式数字pcr用反应预混液10.00µl、浓度为10.00µm的sd1-f 1.80µl、浓度为10.00µm的sd1-r 1.80µl、浓度为10.00µm的hyg-f 1.80µl、浓度为10.00µm的hyg-r 1.80µl、浓度为10.00µm的探针sd1-p 0.50µl、浓度为10.00µm的探针hyg-p 0.50µl、浓度为50.00ng/µl的dna模板 1µl和无核酸酶水0.80µl，总体积20.00µl；

21、反应扩增程序为：95℃ 10min；95℃ 30s，60℃ 1min，45个循环；98℃ 10min；

22、数字pcr反应结束后，将芯片放入生物芯片分析仪中读取fam和vic荧光信号，并使用quantdrop software进行荧光数据分析，得到检测dna模板中外源基因和内参基因的拷贝数（copy/µl），计算转基因糜子中外源基因与内参基因的拷贝数比值，通过比值判断外源基因在转基因糜子基因组中的插入拷贝数。

23、进一步的，采用荧光定量pcr技术检测过程中，转基因糜子中外源基因插入拷贝数的判断方法为：

24、使用quantstudio™ design & analysis software v1.5.2对数据进行分析，采用法分析转基因糜子中 hyg筛选标记基因的相对拷贝数，以双拷贝转基因糜子作为参照因子，即为1，各转基因糜子相对于参照因子拷贝数的倍数为；由于t0代转基因糜子的插入为杂合型，因此双拷贝转基因糜子的相对定量值（rq）应为双拷贝参照的1/2，即外源基因的相对拷贝数约为0.5时转基因糜子为单拷贝插入（也就是外源基因的相对拷贝数为0.26~0.74时转基因糜子为单拷贝插入）；

25、双拷贝转基因糜子的rq值与双拷贝对照相等，即外源基因的相对拷贝数约为1时转基因糜子为双拷贝插入（也就是外源基因的相对拷贝数为0.75~1.25时转基因糜子为双拷贝插入）；

26、三拷贝转基因糜子的相对定量值rq应该为双拷贝对照的3/2，即外源基因的相对拷贝数约为1.5时转基因糜子为三拷贝插入（也就是外源基因的相对拷贝数为1.26~1.74时转基因糜子为三拷贝插入）；

27、以此类推转基因糜子的其它插入拷贝数，例如四拷贝插入、五拷贝插入等。

28、进一步的，采用荧光定量pcr技术检测是以双拷贝转基因糜子作为参照模板，反应在quantstudiotm 1 plus实时荧光定量pcr仪中进行，反应结束后，采用法分析转基因糜子中 hyg筛选标记基因的相对拷贝数；

29、采用荧光定量pcr技术检测过程中，以转基因糜子的基因组dna为dna模板，扩增 sd1基因的反应体系为：2 x qpcr master mix 10.00μl、low rox dye 0.20μl、浓度为10.00µm的sd1-f 0.40µl、浓度为10.00µm的sd1-r 0.40µl、浓度为50.00ng/µl的dna模板2.00μl和ddh2o 7.00μl，总体积为20.00µl；

30、扩增 hyg基因的反应体系为：2 x qpcr master mix 10.00μl、low rox dye 0.20μl、浓度为10.00µm的hyg-f 0.40µl、浓度为10.00µm的hyg-r 0.40µl、浓度为50.00ng/µl的dna模板 2.00μl和ddh2o 7.00μl，总体积为20.00µl；

31、扩增 sd1基因的和 hyg基因的扩增程序均为：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；熔解曲线95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。

32、本发明的一种单拷贝的糜子基因及利用其检测糜子中外源基因插入拷贝数的方法的有益效果为：

33、本发明提供了一个单拷贝的糜子基因，可作为用于转基因糜子中外源基因插入拷贝数的检测的内参基因，以转基因糜子中的最常用的筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hygromycin phosphotransferase， hyg）为外源基因，利用数字pcr与荧光定量pcr技术实现转基因糜子中外源基因插入拷贝数的快速高通量检测；

34、本发明提供了一种利用数字pcr或荧光定量pcr技术高通量检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的方法，具有简单快速、样本要求低、高效、高通量等特点，能够提高大规模筛选转基因株系的效率，可为转基因糜子育种研究中外源基因插入拷贝数的检测提供新的选择；

35、本发明提供的一种利用数字pcr技术检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的方法，可用于所有以 hyg为筛选标记的转基因糜子的拷贝数检测；该方法具有绝对定量、准确度高、简单快速、样本需求量少、能批量检测等优点；

36、本发明提供的一种利用荧光定量pcr技术检测转基因糜子中外源基因插入拷贝数的方法，可用于所有以 hyg为筛选标记的转基因糜子的拷贝数检测；该方法具有简单快速、成本低、样本需求量少等优点，其准确性足以满足检测单低拷贝的育种需求，更适合批量检测。