一种纳豆激酶及其制备方法与流程

本申请涉及生物工程，具体为一种纳豆激酶及其制备方法。

背景技术：

1、随着人口的老龄化、人们生活方式及习惯的改变，肺血栓栓塞症(pte)和深静脉血栓(dvt)、急性冠状动脉综合征(acs)、心房颤动、动脉缺血发作、脑卒中等血栓栓塞性疾病成为全球性的重大健康问题，每年约有1千万人因此死亡，成为导致全球人口死亡的第一位原因。因此世界各国都致力于研究开发治疗血栓性疾病的药物。上世纪80年代，纳豆激酶作为纳豆的核心活性成分被日本学者须见洋行发现。因为它具有溶栓活性高、特异性强、来源广泛、可口服、安全等一系列的优点，得到了国内外研究者的青睐。

2、纳豆激酶是由枯草芽孢杆菌发酵而来，是一种丝氨酸蛋白酶，其是枯草芽孢杆菌发酵过程中产生的胞外酶，主要存在于发酵液中。目前从枯草芽孢杆菌发酵液中提取纳豆激酶通常先初步提取得到纳豆激酶粗品，然后经过凝胶层析、疏水层析、亲和层析和离子交换层析中两种以上的层析方法进行进一步纯化，从而得到纯的纳豆激酶。而制备纳豆激酶粗品通常会先采用有机溶剂沉淀或盐析后透析脱盐初步提取或双水相萃取法。具体的，阎家麒在“豆豉纤溶酶的纯化及其性质研究”一文中提到了上清液中先加入硫酸铵使饱和度至25％离心除去杂蛋白，再加入硫酸铵使饱和度至60％，搅拌溶解后冷处静置过夜。然后弃上清液，离心，收集沉淀，超滤除盐后得豆豉纤溶酶粗品。史延茂在“纳豆激酶分离纯化方法的研究”一文中也提到了当硫酸铵饱和度＜20％时，大量的杂蛋白被沉淀下来而纳豆激酶没有被沉淀下来；而当硫酸铵饱和度＞60％时，纳豆激酶已基本被沉淀下来，因此选择20％～60％的饱和度为硫酸铵二级盐析的饱和度范围。陆瑾在“金属螯合双水相亲和分配技术分离纳豆激酶的研究”一文中提到了利用peg、pes和无机盐配制双水相系统也可以用于纳豆激酶的粗提取。

3、但现有的硫酸铵分步沉淀粗提纳豆激酶的方法，需要两步盐析，两步离心后透析脱盐得到纳豆激酶粗酶液，整个工艺过程繁琐，耗时较长，且造成一定的环境污染。金属螯合双水相系统对发酵液的加入量要求在10-15％，当加入量大于20％，由于蛋白质溶解度的限制以及杂蛋白的干扰，分配系数有较明显下降，而发酵液的加入量小使得在工业生产中难以应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本申请提供一种纳豆激酶及其制备方法，旨在提供一种新型的纳豆激酶的提纯制备方法，具有操作简单、工艺周期较短、浓缩倍数高、收率高的特点。

2、本申请实施例是这样实现的，提供一种纳豆激酶的制备方法，包括：提供枯草芽孢杆菌发酵液的上清液；向所述上清液中加入非离子表面活性剂并混合均匀，然后加入硫酸铵并混合，静置后收集上层的纳豆激酶聚集物；将所述纳豆激酶聚集物复溶于水中，调节ph为6-10后，干燥得到纳豆激酶。

3、在一些实施例中，所述非离子表面活性剂包括烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚二甲基硅氧烷中的一种或多种；和/或，所述非离子表面活性剂与所述上清液的体积比小于等于1：100。

4、在一些实施例中，所述烷基酚聚氧乙烯醚包括壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、十二烷基聚氧乙烯醚、二壬基酚聚氧乙烯醚中的一种或多种；和/或，所述非离子表面活性剂与所述上清液的体积比为(0.10-0.15)：100。

5、在一些实施例中，所述加入硫酸铵并混合，使混合溶液中硫酸铵的饱和度为50％-100％；和/或，所述静置的温度为2℃-10℃；和/或，所述静置的时间为1h-4h。

6、在一些实施例中，使混合溶液中硫酸铵的饱和度为60％-80％；和/或，所述静置的温度为3℃-5℃。

7、在一些实施例中，所述纳豆激酶聚集物与所述水的质量体积比为1:3-1:4；和/或，所述将所述纳豆激酶聚集物复溶于水中，调节ph为8-10；和/或，所述干燥选自喷雾干燥或冷冻干燥。

8、在一些实施例中，所述调节ph为6-10后，还包括加入保护剂的步骤；其中，所述保护剂包括麦芽糊精、海藻糖、甘露醇中的一种或多种，所述保护剂的加入量与所述上清液的质量百分比为7％-10％。

9、在一些实施例中，所述枯草芽孢杆菌发酵液的上清液之前，还包括：将枯草芽孢杆菌进行发酵培养得枯草芽孢杆菌发酵液，离心后得到枯草芽孢杆菌发酵上清液，其中，所述枯草芽孢杆菌保藏号为cctcc no:m2022132。

10、在一些实施例中，所述将枯草芽孢杆菌进行发酵培养得枯草芽孢杆菌发酵液，包括：将枯草芽孢杆菌种子液按照(1％-5％ml)/100ml接种量接种至发酵培养基，其中，每升所述发酵培养基的组分配比为：蛋白胨15.0g-30.0g，葡萄糖15.0g-30.0g，磷酸氢二钠8.0g-12.0g，磷酸二氢钠0.8g-1.2g，硫酸镁0.3g-0.6g，无水氯化钙0.15g-0.30g，聚醚改性硅消泡剂1.0g-1.5g；其中，所述发酵培养基经过了灭菌处理，其中灭菌处理的温度为110℃-120℃，灭菌时间30-60min；在35-40℃、溶氧20％-40％下培养24-48h得到所述枯草芽孢杆菌发酵液。

11、在一些实施例中，所述调节ph为6-10后，干燥后得到纳豆激酶的粗酶粉，然后使用凝胶层析、疏水层析、亲和层析和离子交换层析中的两种以上的层析方法对所述粗酶粉进一步纯化，得电泳纯的纳豆激酶。

12、在另一方面，本申请还提供一种纳豆激酶，由上述纳豆激酶的制备方法制得。

13、本申请至少包括以下有益效果：本申请提供的纳豆激酶的制备方法，利用非离子表面活性剂和硫酸铵体系萃取技术，非离子表面活性剂能够对纳豆激酶进行包裹，而非离子表面活性剂中疏水基支链的存在能够使得纳豆激酶从高浓度硫酸铵溶液中析出，通过复溶后干燥，得到纳豆激酶粗酶粉。本申请的制备方法简单易操作，安全高效，解决了传统工艺纳豆激酶经硫酸铵沉淀操作复杂，耗时久的问题，且整个工艺流程步骤较少，耗时较短，不影响蛋白质活性，收率高。

技术特征：

1.一种纳豆激酶的制备方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂包括烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚二甲基硅氧烷中的一种或多种；和/或，

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述加入硫酸铵并混合，使混合溶液中硫酸铵的饱和度为50％-100％；和/或，

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，使所述混合溶液中硫酸铵的饱和度为60％-80％；和/或，

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳豆激酶聚集物与所述水的质量体积比为1:3-1:4；和/或，

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述调节ph为6-10后，还包括加入保护剂的步骤；其中，所述保护剂包括麦芽糊精、海藻糖、甘露醇中的一种或多种，所述保护剂的加入量与所述上清液的质量百分比为7％-10％。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌发酵液的上清液之前，还包括：

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述调节ph为6-10后，干燥后得到纳豆激酶的粗酶粉，然后使用凝胶层析、疏水层析、亲和层析和离子交换层析中的两种以上的层析方法对所述粗酶粉进一步纯化，得电泳纯的纳豆激酶。

10.一种纳豆激酶，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的纳豆激酶的制备方法制得。

技术总结本申请提供一种纳豆激酶及其制备方法，属于生物工程技术领域领域。本申请提供的纳豆激酶的制备方法，利用非离子表面活性剂和硫酸铵体系萃取技术，非离子表面活性剂能够对纳豆激酶进行包裹，而非离子表面活性剂中疏水基支链的存在能够使得纳豆激酶从高浓度硫酸铵溶液中析出，通过复溶后干燥，得到纳豆激酶粗酶粉。本申请的制备方法简单易操作，安全高效，解决了传统工艺纳豆激酶经硫酸铵沉淀操作复杂，耗时久的问题，且整个工艺流程步骤较少，耗时较短，不影响蛋白质活性，收率高。技术研发人员：高雅,董艳山,王春,吴正喜,范宇鹏,王业富受保护的技术使用者：武汉真福创新生物制药有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10