一种检测人体血清中有机酸磷酯含量的方法

本发明属于生物样品有机污染物检测，具体涉及一种检测人体血清中有机酸磷酯含量的方法。

背景技术：

1、自2003年起，作为持久性有机污染物的多溴联苯醚(polybrominated diphenylethers,pbdes)等溴化阻燃剂(brominated flame retardants,bfr)在全球范围内被逐渐限制使用，有机磷阻燃剂(organophosphorus flame retardant,opfrs)作为其主要替代品在全球的产量及用量迅速增长。2022年全球阻燃剂消费量超过270万吨，其中磷系阻燃剂占比28％，相较于2008年的11％，这个比例提升了2.5倍，opfrs在阻燃剂市场中正逐步占据主导地位，使用量急剧增加。有机磷酸酯(organophosphate esters,opes)是应用最为广泛的opfrs，同时兼有增塑及润滑的作用，被大量应用于电子设备、家装饰品、食品包装、纺织品和工程塑料等领域。opes属于添加型阻燃剂，容易在产品的生产、使用及回收过程中通过挥发、磨损、渗透和溶解等方式泄漏到环境中。目前在水、空气、灰尘、土壤及生物体等多种环境介质中均有opes的检出。大量研究显示，opes具有神经毒性、发育毒性、生殖毒性、致癌作用和内分泌干扰作用等。opes的健康风险问题正在日益凸显，这些化合物是否真的比传统溴系阻燃剂更安全也引起了广泛的思考和研究。

2、目前关于opes环境外暴露评价的研究较多，而评估人体内暴露状况的研究则相对较少。由于opes的应用场景广泛，人体的暴露途径多种多样，内暴露评估能更真实地反映人类对opes的暴露状况。考虑到多种opes在人体内代谢较快、排泄率高且肾脏是主要的排泄器官，所以很多研究以尿液中opes的二酯代谢物水平表征人体opes的暴露负荷，然而近期的研究提示血液opes水平可能是更好的内暴露评估指标，例如wang等[1]的研究显示部分芳基opes和烷基opes在体内代谢相对较快，半衰期小于10天，而氯代烷基opes的半衰期则普遍较长，如tris-chloropropyl-phosphate(tcipp)为15.2天、tris-2-chloroethyl-phosphate(tcep)为17.4天，tris-1,3-dichloro-2-propyl-phosphate(tdcipp)的半衰期甚至达到了53.8天。此外许多opes经体内代谢后可产生相同的二酯类opes，例如磷酸二苯酯(diphenyl phosphate,dphp)可由磷酸三苯酯(triphenyl phosphate,tphp)、磷酸二苯基异辛酯(diphenyl-2-ethylhexyl phosphate，ehdpp)及1,3-苯二酚双(二苯基磷酸酯)(1,3-phenylene bis(diphenyl phosphate，rdp)代谢产生。因此，对于某些opes来说，血液中的浓度水平更能准确地反映人体的累积暴露负荷。此外血液与人体各组织、器官直接接触，污染物容易由此进入组织，血液中化合物的浓度更能代表到达靶部位的剂量，为人体暴露风险评估提供更准确的基础数据。

3、目前已有部分研究对人类血液的opes进行了检测，如qiao等[2]通过索氏提取法结合固相萃取(solid phase extraction,spe)小柱对5ml血清进行预处理，并通过气相色谱-质谱仪(gas chromatography-mass spectrometer,gc-ms)测定opes。wang等[3]采用液液萃取(liquid-liquid extraction,lle)结合双固相萃取柱的预处理方式提取了1ml全血中的opes，并通过超高效液相色谱串联质谱仪(ultra high performance liquidchromatography tandem mass spectrometer,uplc-ms/ms)测定。liu等[4]开发了一种固相萃取的前处理方法，用于500μl血清中opes的提取。但是以上分析方法基本都存在血清用量大、实验成本高(固相萃取柱和大量有机溶剂的消耗等)以及预处理流程繁琐、耗时等问题。

4、基于上述问题，本发明提供一种更加简便和高效的人类血清中opes的检测方法，根据取代基不同，opes可分为烷基类opes、卤代类opes和芳基类opes，本发明在三类opes中分别选择了一些典型的opes作为研究物质。本发明旨在建立并验证一种预处理流程更简单，实验效率更高的人类血清中opes的检测方法。同时，我们还致力于减少血清样本的消耗量，以便更轻松地进行人群opes的暴露评估研究。

5、参考文献：

6、[1]x.wang,q.liu,w.zhong,l.yang,j.yang,a.covaci,l.zhu,estimatingrenaland hepatic clearance rates of organophosphate esters in humans:impactsof intrinsic meta bolism and binding affinity with plasma proteins,environ.int.134(2020)105321.https://doi.org/10.1016/j.envint.2019.105321.

7、[2]l.qiao,x.-b.zheng,j.zheng,w.-x.lei,h.-f.li,m.-h.wang,c.-t.he,s.-j.chen,j.-g.yuan,x.-j.luo,y.-j.yu,z.-y.yang,b.-x.mai,analysis ofhuman hair toassess exposure to organophosphate flame retardants:influence of hairsegments and gender differences,environ.res.148(2016)177-183.https://doi.org/10.1016/j.envres.2016.03.032.

8、[3]x.wang,p.chen,l.zhao,l.zhu,f.wu,transplacental behaviors oforganophos phate tri-and diesters based on paired human maternal and cordwhole blood:efficienc ies and impact factors,environ.sci.technol.55(2021)3091-3100.https://doi.org/10.1021/acs.est.0c06095.

9、[4]y.liu,y.li,n.xiao,m.liu,y.wang,h.luo,y.yao,y.feng,s.wang,seru morganophosphate flame retardants and plasticizers in chinese females ofchildbearing age:association with serum reproductive and thyroid hormones,chemosphere 337(2023)139237.https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2023.139237.

技术实现思路

1、本发明提供一种检测人体血清中有机酸磷酯含量的方法，所提出的分析方法具有灵敏度高、定量准确、血清用量少、操作简单和分析时间短的特点，可用于人群opes的常规生物监测。

2、本发明涉及的术语：

3、在本发明中，tbp为磷酸三丁酯，tcep为三-(β-氯乙基)磷酸酯，tdcpp为三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯，tbep为磷酸三丁氧基乙基酯，tprp为磷酸三丙酯，tphp为磷酸三苯酯，tcipp为三氯丙基磷酸三酯，tep为三乙酸酯，tdbpp为三溴-2,3-二丙基磷酸酯。

4、本发明中，tbp、tcep、tdcpp、tbep、tprp、tphp、tcipp、tep和tdbpp标准品购于catoresearch chemicals(guangzhou,china)。

5、本发明中，氘代同位素内标购于cato research chemicals(guangzhou,china)。

6、本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种检测人体血清中有机酸磷酯含量的方法，具体步骤如下：

7、s1：配制混合标准溶液：依次准确吸取浓度均为100μg/ml的tbp、tcep、tdcpp、tbep、tprp、tphp、tcipp、tep和tdbpp的标准溶液各20μl加于2ml容量瓶中，使用乙腈定容，得到浓度为1μg/ml的混合标准溶液；

8、s2：配制内标混合液：依次准确吸取浓度均为20μg/ml的氘代同位素内标tbp-d27、tphp-d15、tcep-d12、tcipp-d18、和tprp-d21的标准溶液各100μl加于2ml容量瓶中，使用乙腈定容得到浓度为1μg/ml的内标储备液；接着取400μl内标储备液加于1ml容量瓶中，使用乙腈定容，得到浓度为400μg/l的内标混合液；

9、s3：绘制标准工作曲线：取浓度为1μg/ml的混合标准溶液400μl加于1ml容量瓶中，乙腈定容后得到浓度为400μg/l的混合标准液，然后逐级稀释得到浓度为200、100、40、20、10、4和2μg/l的混合标准液，在工作曲线制作过程中，则分别取上述标准溶液10μl于200μl血清中，经过前处理得到浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20ng/ml的标准工作曲线；

10、s4：样品前处理：取200μl血清于玻璃试管中，依次加入10μl浓度为400ng/ml的内标混合液、40μl甲酸以及4ml乙腈，涡旋混匀1min后，以4000rpm的转速离心10min，分离得到上清液和残余部分；转移上清液于另一玻璃试管中，再向残余部分加入2ml乙腈，接着在4000rpm的转速下离心5min，取上清液；合并所述上清液后进行氮吹浓缩，氮吹温度为40℃，在氮吹至干的样品中加入200μl乙腈水溶液，超声复溶5min；最后将复溶液通过0.22μm尼龙针式滤膜转移至带有玻璃内衬管的进样小瓶中，留待上机检测；

11、s5：检测和结果分析：采用液相色谱-质谱仪进行血清中有机酸磷酯含量的检测和结果分析。

12、进一步地，所述有机酸磷酯包括tbp、tcep、tdcpp、tbep、tprp、tphp、tcipp、tep和tdbpp。

13、进一步地，所述s4的乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为1:1。

14、进一步地，所述s5中液相色谱-质谱仪的液相色谱仪为waters超高效液相色谱仪；预柱为waters的beh c18柱，规格为2.1mm×5mm，1.7μm；色谱柱为waters的acquity uplcbeh c18色谱柱，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；隔离柱为waters规格为2.1mm×50mm的隔离柱；质谱仪为waters的xevo g2-xs四级杆-飞行时间高分辨质谱仪。

15、进一步地，所述超高效液相色谱仪的工作条件为：

16、流动相a为0.1％甲酸，b为乙腈，采用梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0-1min，20％b，1-6min，90％b，6-9min，20％b；流速为0.25ml/min，柱温为40℃，样品室温度为10℃，进样量为3μl。

17、进一步地，所述质谱仪的工作条件为：

18、采用电喷雾离子源正离子模式，以氮气作为脱溶剂气和锥孔气，流速分别为30l/h和1000l/h；以氩气作为碰撞气，毛细管电压和离子源缺省电压分别为2.0kv和80v；离子源和脱溶剂气温度分别为120℃和550℃；ms模式下质量采集范围为50-800da，扫描时间为0.3s。

19、与现有技术相比，本说明书实施例采用的上述至少一个技术方案能够达到的有益效果至少包括：

20、(1)本发明的检测方法血清用量少，从相关分析结果可以看出以gc-ms或gc-ms/ms为检测仪器的研究使用了较多的血液样本(0.8-6ml)，近期基于lc-ms/ms的研究所消耗的血清体积要小得多，为0.4-1ml，但是本发明同样采用了uplc-ms/ms作为分析仪器，并通过优化方法，提高目标opes的回收率，成功将血清用量进一步降至200μl，减少了血清基质的消耗；

21、(2)本发明的检测方法所提出的分析方法具有灵敏度高、定量准确、血清用量少、操作简单和分析时间短的特点，可用于人群opes的常规生物监测。