PET水解酶IsPETaseS92P/D157A-cSP的突变体及其应用的制作方法

本发明属于酶工程，涉及一种pet降酶，具体涉及一种pet水解酶 ispetases92p/d157a-csp的突变体及其应用。

背景技术：

1、1950年，全球每年生产塑料约为200万吨；2017年，该数字已飙升至3.48亿吨，并在不断增长。其中，只有大约20%的废弃塑料被循环利用或焚烧处理，大部分塑料被填埋或丢弃于海洋，废弃塑料遍布全球，造成“白色污染”，严重威胁生态系统多样性和人类生命健康。作为全球使用最广泛的塑料之一，聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）因其优异的化学稳定性和机械性能而受到广泛使用，但由于酯键和芳香核的固有化学惰性难以自然降解。通过生物催化再聚合将pet回收到其单体构建块中被认为是pet管理的最理想和最环保的解决方案。生物催化剂在温和的工艺条件下具有高选择性的优势，并且已经报道了几种具有pet降解活性的酶。2016年，日本研究团队从细菌 ideonella sakaiensis中挖掘到pet解聚酶 ispetase，其能够在环境温度下降解pet，并对pet具有良好的底物偏好性，由此pet生物法降解受到广泛关注和研究。然而，野生型的 ispetase虽然在常温下pet降解活性较好，但热稳定性差，极易失活，难以适应工业化生产和pet降解的需要，需要进一步的研究以改善其pet降解活性。虽然中国发明专利cn202210875888.8公开了一种具有高热稳定性的pet水解酶 ispetase-csp突变酶及编码基因及工程菌，在 ispetase野生酶的基础上，提供了一种具有高热稳定性的pet水解酶 ispetase-csp突变酶 ispetases92p/d157a-csp，并使降解pet反应的产量显著提升。但是， ispetases92p/d157a-csp的pet降解活性有待进一步提高。

技术实现思路

1、鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明基于 ispetases92p/d157a-csp进行改造，提供了系列突变酶、及其编码序列、重组质粒和工程菌株，本发明提供的pet水解酶 ispetases92p/d157a-csp的突变体具有较高的pet降解活性，能够显著提高pet的降解效率。

2、为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种pet水解酶 ispetases92p/d157a-csp的突变体，其是将 ispetases92p//d157a-csp的氨基酸序列中的第217位的天冬酰胺定点突变为天冬氨酸，其氨基酸序列如seq id no.3所示，命名为 ispetases92p/d157a/n217d-csp。

4、较 ispetases92p/d157a-csp而言，本发明提供的 ispetases92p/d157a/n217d-csp，在40℃时其pet降解活性提升了61.3%。

5、第二方面，在上述 ispetases92p/d157a/n217d-csp的基础上，本发明进一步筛选有益突变，提供了三种pet水解酶 ispetases92p/d157a-csp的突变体，其氨基酸序列为如下（1）~（3）中的任一项：

6、（1）将 ispetases92p//d157a-csp的氨基酸序列的第217位的天冬酰胺定点突变为天冬氨酸，同时第204位的天冬酰胺定点突变为亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得氨基酸序列如seq id no.4所示，命名为pad-n204l；

7、（2）将 ispetases92p//d157a-csp的氨基酸序列的第217位的天冬酰胺定点突变为天冬氨酸，同时第58位的酪氨酸定点突变为苯丙氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得氨基酸序列如seq id no.5所示，命名为pad-y58f；

8、（3）将 ispetases92p//d157a-csp的氨基酸序列的第217位的天冬酰胺定点突变为天冬氨酸，同时第204位的天冬酰胺定点突变为亮氨酸、第58位的酪氨酸定点突变为苯丙氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得氨基酸序列如seq id no.6所示，命名为pad-y58f-n204l。

9、经测试发现，相较于 ispetases92p//d157a-csp，上述三种突变体在30~50℃的pet降解活性均显著提高。其中，相较于 ispetases92p//d157a-csp，突变体pad-n204l在30℃时pet降解活性提升了57.1%、在40℃时pet降解活性提升了70.6%、在50℃时pet降解活性提升了121.9%；突变体pad-y58f在30℃时pet降解活性提升了141.9%、在40℃时pet降解活性提升了166.9%、在50℃时pet降解活性提升了55.8%；突变体pad-y58f-n204l在30℃时pet降解活性提升了158.1%、在40℃时pet降解活性提升了104.2%、在50℃时pet降解活性提升了240.3%。

10、其中，pad代表 ispetases92p/d157a/n217d-csp。

11、第三方面，本发明提供了编码seq id no.3~6任一项所示氨基酸序列的dna分子。

12、第四方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含编码seq id no.3~6任一项所示氨基酸序列的dna分子。

13、第五方面，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株包含第四方面所述的重组质粒。

14、第六方面，本发明提供上述pet水解酶 ispetases92p/d157a-csp的突变体在降解pet、制备pet降解剂或制备降解pet产品中的应用。

15、优选地，所述pet水解酶 ispetases92p/d157a-csp的突变体应用于降解pet时，可在30～50℃条件下进行。

16、经本发明改造后的 ispetases92p/d157a-csp突变体其pet降解活性显著增强，可用于pet的生物酶法高效降解，以促进pet回收再利用，减少环境污染和资源浪费。