用于治疗肿瘤的ROR1CAR或ROR1/CD19双CART细胞的制作方法

本发明属于生物医学或生物药物领域，具体涉及通过细胞疗法治疗肿瘤，并且更具体涉及使用表达ror1 car或ror1/cd19双car的转基因t淋巴细胞治疗高表达受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)或同时表达ror1和cd19的肿瘤。

背景技术：

1、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)是由ror1和ror2组成的ror家族内的跨膜蛋白。人ror1/2具有总体58％的氨基酸同一性，在激酶结构域中具有68％的氨基酸同一性。氨基酸序列同一性在ror1和ror2亚组中的不同物种之间分别是高度保守的。注意到人和小鼠ror1(hror1和mror1)之间有97％的氨基酸序列同一性。人ror1位于染色体1(1p31.3)上，其中蛋白质大小为937个氨基酸并且分子量为约105kda。人ror1的结构由氨基末端的胞外免疫球蛋白样(ig)结构域、卷曲(fz)结构域、环状(kr)结构域、跨膜结构域、酪氨酸激酶结构域、富含丝氨酸/苏氨酸的结构域(ser/thr)、富含脯氨酸(pr)的结构域和羧基末端的第二个ser/thr结构域组成。ig结构域位于胞外部分的远端。ig结构域的确切作用是未知的，但它可能涉及蛋白质和配体相互作用以及干扰fz和kr结构域。fz结构域与卷曲受体的wnt结合结构域相似，并被认为介导ror1受体与其配体诸如wnt5a之间的相互作用。kr结构域是高度折叠的富含半胱氨酸的结构域，其位于质膜附近，是ror1和ror2异二聚化所需的。

2、尽管ror1表达主要在胚胎期，但有广泛的证据表明ror1的高表达水平与血液恶性肿瘤和实体瘤两者相关。ror1的强表达最初发现于b细胞慢性淋巴细胞白血病(cll)中，而在健康的外周血单核细胞(pbmc)中完全不存在。进一步的研究表明，ror1表达和基因表达两者在若干种另外的血液恶性肿瘤诸如急性淋巴细胞白血病(all)、套细胞淋巴瘤(mcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、边缘区淋巴瘤(mzl)、骨髓瘤和髓性白血病中均上调。此外，ror1表达和疾病进展之间存在相关性。1568名cll患者的转录组分析揭示，表达高水平的ror1的cll病例倾向于具有比表达低水平的ror1的患者更具侵袭性的疾病进展和更短的总体存活时间。

3、还在各种实体瘤中观察到ror1表达。对多种实体癌的免疫组织化学(ihc)分析揭示了ror1表达模式根据癌症类型从中等到高度的变化。ror1阳性样品包括卵巢癌(78/144)、皮肤癌(49/55)、胰腺癌(45/57)、结肠癌(63/110)、肺癌(52/58)、肾上腺癌(10/12)、子宫癌(28/29)和睾丸癌(35/48)和前列腺癌(19/21)。在乳腺癌中，显示ror1在人肿瘤细胞中表达，但在基质细胞中不存在。乳腺癌中ror1过表达与侵袭性疾病有关。具有强ror1表达的乳腺癌细胞系更具侵袭性和侵入性，但在非迁移细胞中下降。232名肺腺癌(adc)患者的ihc研究支持将ror1表达鉴定为肺adc的临床病理学特征。这些ihc分析显示，57.9％的肺adc患者在iii期至iv期表现出ror1蛋白的高表达，而仅21.3％的患者在i期至ii期表现出高ror1表达。此外，存活分析还表明高ror1表达和较差的总体存活率之间存在线性关系。总之，本文献提供了有力证据支持将ror1鉴定为抗癌疗法的有希望的治疗靶标。

4、近年来，许多制药公司已经开发了靶向ror1的药物，包括单克隆抗体、抗体-药物偶联物(adc)、双特异性抗体、car-t疗法等。

5、此外，oncternal therapeutics的ror1单克隆抗体zilovertamab(以前称为cirmtuzumab或uc-961)与依鲁替尼(ibrutinib)联合用于治疗复发/难治性细胞淋巴瘤或原发性/难治性慢性淋巴细胞白血病的1/2期临床研究已获得了积极数据；而velosbio已经公开了研究药物vls-101(靶向ror1的adc药物)的1期临床试验数据，显示出安全性和抗肿瘤功效。

6、car t细胞对肿瘤抗原的靶向作用导致肿瘤相关抗原的选择性压力和下调，这一过程称为抗原逃逸。在抗原逃逸期间，第二肿瘤相关抗原可由肿瘤细胞诸如cd19上调。另据报道，cd19在b细胞恶性肿瘤和其他类型的肿瘤细胞中与ror1共表达。两种抗原的双重靶向是预防抗原逃逸导致肿瘤复发的有效方式。在肿瘤细胞表达多种肿瘤相关抗原的情况下，这种双重靶向可以是增强car效力的有效方式。

7、如何提供一种高表达受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)或高表达受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)和cd19两者的肿瘤的治疗方法已被公认为本领域中有待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明提供了ror1 car或ror1/cd19双car，它们用于治疗高表达受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)或高表达受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)和cd19两者的肿瘤。

2、在第一方面，本发明提供了结合ror1的嵌合抗原受体(car)，其中该car包含信号肽、抗体或其抗原结合片段、铰链结构域、跨膜结构域和/或胞内结构域。

3、在一个实施方案中，该信号肽可选自cd8α信号肽、vh3信号肽、il2信号肽等；该铰链结构域可选自cd8铰链结构域、cd28铰链结构域等；该跨膜结构域可选自cd8α跨膜结构域、cd28跨膜结构域、4-1bb跨膜结构域或跨膜-近膜结构域等，并且该跨膜-近膜结构域可选自癫痫发作6样蛋白2(sez6l2)跨膜-近膜结构域等；并且该胞内结构域可选自cd28胞内结构域、4-1bb胞内结构域、ox40胞内结构域、cd3ζ胞内结构域等。

4、在另一个实施方案中，该信号肽是cd8α信号肽，该铰链结构域是cd8铰链结构域，该跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或癫痫发作6样蛋白2(sez6l2)跨膜-近膜结构域，并且该胞内结构域是4-1bb胞内结构域和/或cd3ζ胞内结构域。

5、在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是ror1；优选地，scfv的vh和vl通过接头连接；优选地，通过(ggggs)3或(ggggsggggsggggs)接头；优选地，从n末端到c末端依次为vh-(ggggs)3-vl。

6、在一个具体实施方案中，本发明提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包含，

7、(1)胞外配体结合结构域，其包含与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)特异性结合的scfv；

8、(2)跨膜结构域；其中优选地，该跨膜结构域是cd8跨膜结构域；或

9、跨膜(tm)连接近膜(jm)结构域，其中该跨膜连接近膜结构域包含癫痫发作6样蛋白2(sez6l2)跨膜结构域和sez6l2近膜结构域；和

10、(3)胞内结构域；其中优选地，该胞内结构域包含信号传导结构域；更优选地，该信号传导结构域包括选自以下项的一个或多个信号传导结构域：4-1bb信号传导结构域、cd28信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域；

11、其中与ror1特异性结合的scfv包含：

12、seq id no.:10所示的hcdr1、seq id no.:11所示的hcdr2、seq id no.:12所示的hcdr3、seq id no.:27所示的lcdr1、seq id no.:28所示的lcdr2和seq id no.:29所示的lcdr3；

13、seq id no.:1所示的hcdr1、seq id no.:2所示的hcdr2、seq id no.:3所示的hcdr3、seq id no.:18所示的lcdr1、seq id no.:19所示的lcdr2和seq id no.:20所示的lcdr3；

14、seq id no.:4所示的hcdr1、seq id no.:5所示的hcdr2、seq id no.:6所示的hcdr3、seq id no.:21所示的lcdr1、seq id no.:22所示的lcdr2和seq id no.:23所示的lcdr3；

15、seq id no.:7所示的hcdr1、seq id no.:8所示的hcdr2、seq id no.:9所示的hcdr3、seq id no.:24所示的lcdr1、seq id no.:25所示的lcdr2和seq id no.:26所示的lcdr3；

16、seq id no.:10所示的hcdr1、seq id no.:11所示的hcdr2、seq id no.:12所示的hcdr3、seq id no.:27所示的lcdr1、seq id no.:28所示的lcdr2和seq id no.:29所示的lcdr3；

17、seq id no.:13所示的hcdr1、seq id no.:14所示的hcdr2、seq id no.:15所示的hcdr3、seq id no.:30所示的lcdr1、seq id no.:31所示的lcdr2和seq id no.:32所示的lcdr3；

18、seq id no.:10所示的hcdr1、seq id no.:16所示的hcdr2、seq id no.:17所示的hcdr3、seq id no.:33所示的lcdr1、seq id no.:34所示的lcdr2和seq id no.:35所示的lcdr3；

19、seq id no.:10所示的hcdr1、seq id no.:11所示的hcdr2、seq id no.:12所示的hcdr3、seq id no.:27所示的lcdr1、seq id no.:28所示的lcdr2和seq id no.:29所示的lcdr3；或

20、seq id no.:83所示的hcdr1、seq id no.:84所示的hcdr2、seq id no.:85所示的hcdr3、seq id no.:86所示的lcdr1、seq id no.:87所示的lcdr2和seq id no.:88所示的lcdr3。

21、在一个实施方案中，与ror1特异性结合的scfv包含：

22、含有与seq id no.:57所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:59所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

23、含有与seq id no.:44所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:50所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

24、含有与seq id no.:45所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:51所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

25、含有与seq id no.:46所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:52所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

26、含有与seq id no.:47所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:53所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

27、含有与seq id no.:48所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:54所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

28、含有与seq id no.:49所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:55所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

29、含有与seq id no.:56所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:59所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

30、含有与seq id no.:57所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:58所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；或者

31、含有与seq id no.:81所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:82所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl。

32、在另一个实施方案中，所述car从n末端到c末端包含：

33、1)ror1 scfv-cd8铰链-cd8 tm-4-1bb-cd3ζ；或

34、2)ror1 scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；

35、其中优选地，car的n末端还含有前导序列。

36、在另一个实施方案中，该前导序列包含与seq id no.61所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

37、在另一个实施方案中，cd8铰链包含与seq id no.:62所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

38、在另一个实施方案中，cd8tm包含与seq id no.:63所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

39、在另一个实施方案中，4-1bb包含与seq id no.:64所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

40、在另一个实施方案中，cd3ζ胞内结构域包含与seq id no.:65所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

41、在另一个实施方案中，所述sez6l2跨膜-近膜结构域包含与seq id no.:66所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

42、在另一个实施方案中，其中car从n末端到c末端包含：

43、1)ror1 scfv-cd8铰链-cd8 tm-4-1bb-cd3ζ；或

44、2)ror1 scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；

45、所述car的n末端还含有前导序列，其中该前导序列包含与seq id no.61所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

46、所述cd8铰链包含与seq id no.:62所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

47、所述cd8 tm包含与seq id no.:63所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

48、所述4-1bb包含与seq id no.:64所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

49、所述cd3ζ胞内结构域包含与seq id no.:65所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且

50、所述sez6l2跨膜-近膜结构域(sez6l2 tm jm)包含与seq id no.:66所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

51、在优选的实施方案中，ror1 car从n末端到c末端包含：

52、1)ror1 scfv-cd8铰链-cd8 tm-4-1bb-cd3ζ；或

53、2)ror1 scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；

54、其中ror1 scfv包含：seq id no.:10所示的hcdr1、seq id no.:11所示的hcdr2、seq id no.:12所示的hcdr3、seq id no.:27所示的lcdr1、seq id no.:28所示的lcdr2和seq id no.:29所示的lcdr3；

55、其中优选地，ror1 scfv包含：seq id no.:57所示的vh和seq id no.:59所示的vl；其中

56、其中ror1 car还含有前导序列，其中该前导序列包含与seq id no.61所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

57、所述cd8铰链包含与seq id no.:62所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

58、所述cd8 tm包含与seq id no.:63所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

59、所述4-1bb包含与seq id no.:64所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

60、所述cd3ζ胞内结构域包含与seq id no.:65所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且

61、所述sez6l2跨膜-近膜结构域(sez6l2 tm jm)包含与seq id no.:66所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

62、在一个具体实施方案中，本发明提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包含，

63、(1)胞外配体结合结构域，其包含与cd19特异性结合的scfv；

64、(2)跨膜结构域；其中优选地，该跨膜结构域是cd8跨膜结构域；或

65、跨膜(tm)连接近膜(jm)结构域，其中该跨膜连接近膜结构域包含癫痫发作6样蛋白2(sez6l2)跨膜结构域和sez6l2近膜结构域；

66、(3)胞内结构域；其中优选地，该胞内结构域包含信号传导结构域；更优选地，该信号传导结构域包括选自以下项的一个或多个信号传导结构域：4-1bb信号传导结构域、cd28信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域；

67、其中与cd19特异性结合的scfv包含：

68、seq id no.:37所示的hcdr1、seq id no.:38所示的hcdr2、seq id no.:39所示的hcdr3、seq id no.:41所示的lcdr1、seq id no.:42所示的lcdr2和seq id no.:43所示的lcdr3；或

69、seq id no.:37所示的hcdr1、seq id no.:38所示的hcdr2、seq id no.:40所示的hcdr3、seq id no.:41所示的lcdr1、seq id no.:42所示的lcdr2和seq id no.:43所示的lcdr3。

70、在一个实施方案中，与cd19特异性结合的scfv包含：

71、含有与seq id no.:69所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:70所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

72、含有与seq id no.:71所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:75所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

73、含有与seq id no.:71所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:76所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

74、含有与seq id no.:71所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:77所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

75、含有与seq id no.:71所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:78所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

76、含有与seq id no.:72所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:75所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

77、含有与seq id no.:72所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:76所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

78、含有与seq id no.:72所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:77所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

79、含有与seq id no.:72所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:78所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

80、含有与seq id no.:73所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:75所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

81、含有与seq id no.:73所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:76所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

82、含有与seq id no.:73所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:77所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

83、含有与seq id no.:73所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:78所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

84、含有与seq id no.:74所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:75所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

85、含有与seq id no.:74所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:76所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；

86、含有与seq id no.:74所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:77所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl；或者

87、含有与seq id no.:74所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vh以及含有与seq id no.:78所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vl。

88、在另一个实施方案中，car从n末端到c末端包含：

89、1)cd19 scfv-cd8铰链-cd8 tm-4-1bb-cd3ζ；或

90、2)cd19 scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；

91、其中优选地，car的n末端还含有前导序列。

92、在另一个实施方案中，该前导序列包含与seq id no.61所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

93、在另一个实施方案中，cd8铰链包含与seq id no.:62所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

94、在另一个实施方案中，cd8tm包含与seq id no.:63所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

95、在另一个实施方案中，4-1bb包含与seq id no.:64所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

96、在另一个实施方案中，cd3ζ胞内结构域包含与seq id no.:65所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

97、在另一个实施方案中，sez6l2跨膜-近膜结构域包含与seq id no.:66所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

98、在另一个实施方案中，car从n末端到c末端包含：

99、1)cd19 scfv-cd8铰链-cd8 tm-4-1bb-cd3ζ；或

100、2)cd19 scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；

101、其中car的n末端还含有前导序列，其中该前导序列包含与seq id no.61所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

102、所述cd8铰链包含与seq id no.:62所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

103、所述cd8 tm包含与seq id no.:63所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

104、所述4-1bb包含与seq id no.:64所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

105、所述cd3ζ胞内结构域包含与seq id no.:65所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且

106、所述sez6l2跨膜-近膜结构域(sez6l2 tm jm)包含与seq id no.:66所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

107、在优选的实施方案中，cd19 car从n末端到c末端包含：

108、1)cd19 scfv-cd8铰链-cd8 tm-4-1bb-cd3ζ；或

109、2)cd19 scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；并且

110、cd19 scfv包含：seq id no.:37所示的hcdr1、seq id no.:38所示的hcdr2、seqid no.:39所示的hcdr3、seq id no.:41所示的lcdr1、seq id no.:42所示的lcdr2和seqid no.:43所示的lcdr3；其中

111、优选地，cd19 scfv包含：seq id no.:69所示的vh和seq id no.:70所示的vl；并且

112、优选地，seq id no.:66所示的sez6l2跨膜-近膜结构域(sez6l2 tm jm)。

113、在第二方面，本发明提供了一种双car，其包含：第一car，和

114、第二car，其包含：

115、(1)胞外配体结合结构域，其包含与预先确定的抗原特异性结合的scfv；其中该预先确定的抗原是肿瘤相关抗原(taa)；更优选地，该taa选自以下项中的一个或多个：cea、claudin 18.2、cgc3、cd38、cd19、cd20、cd22、bcma、caix、cd446、cd13、egfr、egfrviii、epcam、gd2、epha2、her1、her2、icam-1、il13ra2、间皮素、muc1、muc16、psca、ny-eso-1、mart-1、wt1、mage-a10、mage-a3、mage-a4、ebv、nkg2d、pd1、pd-l1、cd25、il-2和cd3；

116、(2)跨膜结构域，其中优选地，该跨膜结构域是cd8跨膜结构域；或

117、跨膜(tm)连接近膜(jm)结构域，其中该跨膜连接近膜结构域包含癫痫发作6样蛋白2(sez6l2)跨膜结构域和sez6l2近膜结构域；

118、(3)胞内结构域；其中优选地，该胞内结构域包含信号传导结构域；更优选地，该信号传导结构域包括选自以下项的一个或多个信号传导结构域：4-1bb信号传导结构域、cd28信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域；

119、优选地，该第一car靶向ror1，并且该第二car靶向另一抗原，

120、优选地，该第一car和该第二car通过p2a连接。

121、在一个实施方案中，所述taa是cd19，并且cd19 scfv包含：

122、seq id no.:37所示的hcdr1、seq id no.:38所示的hcdr2、seq id no.:39所示的hcdr3、seq id no.:41所示的lcdr1、seq id no.:42所示的lcdr2和seq id no.:43所示的lcdr3；或

123、seq id no.:37所示的hcdr1、seq id no.:38所示的hcdr2、seq id no.:40所示的hcdr3、seq id no.:41所示的lcdr1、seq id no.:42所示的lcdr2和seq id no.:43所示的lcdr3。

124、在另一个实施方案中，所述cd19 scfv包含：

125、seq id no.:69所示的vh和seq id no.:70所示的vl；

126、seq id no.:71所示的vh和seq id no.:75所示的vl；

127、seq id no.:71所示的vh和seq id no.:76所示的vl；

128、seq id no.:71所示的vh和seq id no.:77所示的vl；

129、seq id no.:71所示的vh和seq id no.:78所示的vl；

130、seq id no.:72所示的vh和seq id no.:75所示的vl；

131、seq id no.:72所示的vh和seq id no.:76所示的vl；

132、seq id no.:72所示的vh和seq id no.:77所示的vl；

133、seq id no.:72所示的vh和seq id no.:78所示的vl；

134、seq id no.:73所示的vh和seq id no.:75所示的vl；

135、seq id no.:73所示的vh和seq id no.:76所示的vl；

136、seq id no.:73所示的vh和seq id no.:77所示的vl；

137、seq id no.:73所示的vh和seq id no.:78所示的vl；

138、seq id no.:74所示的vh和seq id no.:75所示的vl；

139、seq id no.:74所示的vh和seq id no.:76所示的vl；

140、seq id no.:74所示的vh和seq id no.:77所示的vl；或

141、seq id no.:74所示的vh和seq id no.:78所示的vl。

142、在另一个实施方案中，所述双car从n末端到c末端包含：

143、taa scfv-cd8铰链-cd8tm-4-1bb-cd3ζ-p2a-ror1scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；或

144、ror1scfv-cd8铰链-cd8tm-4-1bb-cd3ζ-p2a-taa scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；其中

145、优选地，car的n末端还含有前导序列；并且

146、优选地，car的c末端还含有p2a-egfp序列。

147、在另一个实施方案中，该前导序列包含与seq id no.61所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

148、在另一个实施方案中，所述cd8铰链包含与seq id no.:62所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

149、在另一个实施方案中，所述cd8tm包含与seq id no.:63所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

150、在另一个实施方案中，所述4-1bb包含与seq id no.:64所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

151、在另一个实施方案中，所述cd3ζ胞内结构域包含与seq id no.:65所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

152、在另一个实施方案中，所述sez6l2跨膜-近膜结构域包含与seq id no.:66所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

153、在另一个实施方案中，所述egfp包含与seq id no.:67所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

154、在另一个实施方案中，该p2a包含与seq id no.:68所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

155、在另一个实施方案中，所述双car从n末端到c末端包含：

156、taa scfv-cd8铰链-cd8tm-4-1bb-cd3ζ-p2a-ror1scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；或

157、ror1scfv-cd8铰链-cd8tm-4-1bb-cd3ζ-p2a-taa scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；其中

158、car的n末端还含有前导序列，并且car的c末端还含有p2a-egfp序列，其中，

159、该前导序列包含与seq id no.61所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

160、所述cd8铰链包含与seq id no.:62所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

161、所述cd8tm包含与seq id no.:63所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

162、所述4-1bb胞内结构域包含与seq id no.:64所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

163、所述cd3ζ胞内结构域包含与seq id no.:65所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

164、所述sez6l2跨膜-近膜结构域(sez6l2 tm jm)包含与seq id no.:66所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，

165、所述egfp包含与seq id no.:67所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且

166、该p2a包含与seq id no.68所示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

167、在优选的实施方案中，双car从n末端到c末端包含：

168、cd19 scfv-cd8铰链-cd8tm-4-1bb-cd3ζ-p2a-ror1scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；或

169、ror1scfv-cd8铰链-cd8tm-4-1bb-cd3ζ-p2a-cd19 scfv-cd8铰链-sez6l2 tm jm-cd3ζ；

170、其中ror1 scfv包含：seq id no.:10所示的hcdr1、seq id no.:11所示的hcdr2、seq id no.:12所示的hcdr3、seq id no.:27所示的lcdr1、seq id no.:28所示的lcdr2和seq id no.:29所示的lcdr3；其中优选地，ror1 scfv包含：seq id no.:57所示的vh和seqid no.:59所示的vl；

171、所述cd19 scfv包含：seq id no.:37所示的hcdr1、seq id no.:38所示的hcdr2、seq id no.:39所示的hcdr3、seq id no.:41所示的lcdr1、seq id no.:42所示的lcdr2和seq id no.:43所示的lcdr3；其中优选地，cd19 scfv包含：seq id no.:69所示的vh和seqid no.:70所示的vl；

172、其中优选地，seq id no.:66所示的sez6l2跨膜-近膜结构域(sez6l2 tm jm)。

173、在第三方面，本发明提供了包含编码上述car或双car的多核苷酸的核酸。

174、在第四方面，本发明提供了包含编码上述car或双car的多核苷酸或上述核酸的载体。优选地，载体可以是病毒载体；优选地，该病毒载体包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体等；优选地，载体可以是非病毒载体；优选地，该非病毒载体可以是转座子载体；优选地，该转座子载体可以是sleeping beauty载体或piggybac载体等；优选地，载体可以是哺乳细胞表达载体；优选地，该表达载体可以是细菌表达载体；优选地，该表达载体可以是真菌表达载体。

175、在第五方面，本发明提供了包含car或双car，或根据前述方面中任一项所述的核酸或载体的细胞。本发明还提供了能够表达根据前述方面中任一项所述的car或双car的细胞。优选地，细胞为细菌细胞；优选地，该细菌细胞为大肠杆菌细胞等；优选地，细胞为真菌细胞；优选地，该真菌细胞为酵母细胞；优选地，该酵母细胞为毕赤酵母细胞等；优选地，细胞为哺乳动物细胞；并且优选地，该哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(cho)、人胚胎肾细胞(293)、干细胞、b细胞、t细胞、dc细胞、nk细胞等。本发明提供了包含根据前述方面中任一项所述的核酸或载体的car-t细胞。本发明还提供了能够表达根据前述方面中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或嵌合抗原受体的car-t细胞。

176、在第六方面，本发明提供了一种组合物，其包含根据前述方面中任一项所述的car或双car、核酸或载体、或细胞。此外，该组合物包含根据前述方面中任一项所述的细胞和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括以下载体中的一个或多个：药学上可接受的溶媒、分散剂、添加剂、增塑剂和赋形剂。此外，组合物还可以包含其他治疗剂。在一些实施方案中，其他治疗剂包括但不限于化疗剂、免疫治疗剂或激素治疗剂。

177、在第七方面，本发明提供了治疗有需要的受试者的疾病的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的根据前述方面中任一项所述的组合物、或car、或双car、或核酸、或载体、或细胞。

178、在另一个实施方案中，该疾病是ror1阳性癌症，该疾病是cd19阳性癌症，或者该疾病是ror1阳性癌症和cd19阳性癌症两者。优选地，该癌症选自血癌和实体癌中的一种或多种；优选地，该癌症包括但不限于胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、宫颈癌、肉瘤、细胞瘤、结肠癌、肾脏癌、结肠直肠癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、肾上腺癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、血癌、白血病或淋巴瘤。

179、在第八方面，本发明提供了治疗ror1和cd19双阳性癌症的方法，该方法包括向受试者施用根据前述方面中任一项所述的双car；优选地，该癌症选自血癌和实体癌中的一种或多种；优选地，该癌症包括但不限于胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、宫颈癌、肉瘤、细胞瘤、结肠癌、肾脏癌、结肠直肠癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、肾上腺癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、血癌、白血病或淋巴瘤。

180、在第九方面，本发明提供了一种产生car-t细胞的方法，该方法包括：

181、(1)将根据前述方面中任一项所述的核酸或载体导入宿主细胞中，以及

182、(2)在该引入之后分离和/或扩增car-t细胞。

183、本技术具有以下优势：

184、1)表达本技术的ror1 car的jurkat nfat-荧光素酶报告细胞可被ror1阳性sk-hep-1细胞刺激；

185、2)本技术的ror1 car对mcf7、hepg2、sk-hep-1和mda-mb-231靶细胞具有不同细胞毒性。

186、3)cd19阳性raji细胞可刺激表达本技术的表达cd19 car的jurkat nfat-荧光素酶报告细胞；

187、4)本技术的cd19 car对cd19阳性raji、jeko-1和nalm6细胞具有细胞毒性；

188、5)双靶向ror1/cd19 car构建体可具有改善的对具有较低细胞因子释放水平的双阳性肿瘤的治疗效果。