一种用于培养血管化肝脏类器官的培养基及培养方法和应用

本发明涉及生物医学，尤其是涉及一种用于培养血管化肝脏类器官的培养基及培养方法和应用。

背景技术：

1、类器官可在一定程度上模拟器官功能，用于基础研究和药物筛选。例如，有一些研究报道利用成体肝脏细胞、胚胎肝脏细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞在体外构建肝脏类器官，用于疾病研究。微血管在器官和组织的正常功能维持和疾病发生过程中起重要作用，构建血管化类器官可以更好地模拟体内微环境，用于基础研究和药物筛选。已有一些血管类器官技术报道，如申请号为202311381600.2的中国专利血管化人成体肺类器官及其构建方法，公开了利用多能干细胞分化形成的血管祖细胞与人肺类器官共培养形成血管化肺类器官；申请号为202211653816.5的中国专利类器官培养基及其应用以及血管化肝脏类器官及其构建方法，公开了将多能干细胞分化生成微血管类器官和肝脏类器官，二者共培养形成血管化肝脏类器官。

2、现有的血管化肝脏类器官技术有一些不足之处，例如，利用多能干细胞分化所形成的微血管和肝脏细胞与成体组织中的细胞仍有一定差别，由于各个器官都有其特异的血管细胞类型，现有的多能干细胞分化技术难以获得组织特异性的微血管，难以准确模拟成体肝脏组织。另外，目前的血管化肝脏类器官技术不能模拟肝脏纤维化过程中组织变硬的环境，难以应用于纤维化研究和药物筛选。目前纤维化研究模型一般利用人工合成聚合物，虽然能够较好地调控硬度，但是仍然需要额外修饰细胞黏附分子，不是天然的细胞外基质。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种用于培养血管化肝脏类器官的培养基，以解决现有技术中的培养基无法实现从同一个成体肝脏组织中分离原代肝脏细胞、星状细胞以及微血管进行体外共培养制备血管化肝脏类器官的技术问题。

2、本发明的目的之二在于提供一种培养血管化肝脏类器官的培养方法，以解决现有技术中血管化肝脏类器官的培养技术难以准确模拟成体肝脏组织，且无法模拟肝脏纤维化过程中组织变硬的环境导致无法应用于纤维化研究和药物筛选的技术问题。

3、本发明的目的之三在于提供上述的培养基或上述的培养方法在筛选纤维化药物中的应用。

4、本发明的目的之四在于提供一种筛选抗纤维化药物的方法。

5、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

6、第一方面，本发明提供了一种用于培养血管化肝脏类器官的培养基，由基础培养基和添加物组成，所述添加物由以下浓度的组分组成：1～20％(v/v)的胎牛血清、1～10mg/ml bsa、50～100u/ml青霉素、50～100μg/ml链霉素、0.125～0.25μg/ml的两性霉素b、1～20mm的nicotinamide、1～10mm的n-acetyl-l-cysteine、10～100μm的vitamin c、1～10μm的glutathione、1～20μg/ml的insulin、1～20μg/ml的transferrin、10～100nm的sodiumselenite、5～50ng/ml的血管内皮生长因子vegf、1～5μm的gsk3抑制剂和5～10μm的rock抑制剂；

7、所述基础培养基包括dmem/f12、dmem或rpmi 1640。

8、进一步的，所述gsk3抑制剂包括chir99021、sb415286或chir-98014，优选为chir99021。

9、进一步的，rock抑制剂包括y27632、sb-772077b或y-33075，优选为y27632。

10、第二方面，本发明提供了一种血管化肝脏类器官的培养方法，使用上述的培养基在胞外基质基底上培养成体肝脏细胞，得到血管化肝脏类器官。

11、进一步的，所述成体肝脏细胞的制备方法包括取成体肝脏组织进行循环消化得到成体肝脏细胞；

12、所述循环消化包括以下步骤：

13、a、每10～20min取出含有已消化下的细胞的消化液，收集细胞沉淀，加入培养基重悬后保存备用，向剩余的未消化的成体肝脏组织中加入新的消化液；

14、b、重复步骤a直至所有成体肝脏组织消化完为止；

15、优选地，所述成体肝脏组织为2～5mm直径大小；

16、优选地，所述消化的条件为36～38℃消化，优选为37℃消化；

17、优选地，所述保存的温度为0～4℃；

18、优选地，所述循环消化之后还包括过滤消化后得到的成体肝脏细胞。

19、进一步的，所述消化液由基础培养基、i型胶原酶、dna酶、bsa和rock抑制剂组成；

20、优选地，所述i型胶原酶在消化液中的浓度为1～3mg/ml，优选为2mg/ml；

21、优选地，dna酶在消化液中的浓度为0.01～0.2mg/ml，优选为0.05mg/ml；

22、优选地，bsa在消化液中的浓度为1～10mg/ml，优选为5mg/ml；

23、优选地，所述rock抑制剂在消化液中的中浓度为1～10μm，优选为5μm；

24、优选地，所述rock抑制剂包括y27632、sb-772077b或y-33075，优选为y27632。

25、进一步的，所述培养时间为至少4d；

26、优选地，所述培养条件包括：在37℃恒温、95％湿度和5％co2的培养箱中进行培养；

27、优选地，所述培养还包括每24h更换一次新的培养基。

28、第三方面，本发明提供了上述的培养基或上述的培养方法在筛选纤维化药物中的应用。

29、第四方面，本发明提供了一种筛选抗纤维化药物的方法，包括以下步骤：

30、a、应用权利要求4～7任一项所述的培养方法制备纤维化组织微环境血管化肝脏类器官和正常组织微环境血管化肝脏类器官；

31、b、分别在步骤a制备的纤维化组织微环境血管化肝脏类器官和正常组织微环境血管化肝脏类器官的培养基中加入待筛选药物进行共培养；

32、c、根据纤维化标志物基因、微血管标志物基因与肝脏上皮细胞标志物基因分别在纤维化组织微环境下的血管化肝脏类器官和正常组织微环境下的血管化肝脏类器官中的表达量，筛选抗纤维化药物。

33、进一步的，所述步骤c包括若纤维化组织微环境下的血管化肝脏类器官中纤维化标志物基因的表达量相对于加入待筛选药物前显著降低，且正常组织微环境血管化肝脏类器中微血管标志物基因与肝脏上皮细胞标志物基因的表达量相对于加入待筛选药物前无显著降低，则待筛选药物为抗纤维化药物；

34、优选地，所述纤维化标志物基因包括col1a1、col3a1、acta2(sma)、fn1、fap、vim、postn、lox；

35、优选地，所述肝脏上皮细胞标志物基因包括cdh1(e-cadherin)、krt8、krt18、alb、krt7、krt19；

36、优选地，所述肝脏星状细胞标志物基因包括desmin(des)、pdgfrb、lrat；

37、优选地，所述微血管标志物基因包括apln、tek、tie1、pecam(cd31)、cdh5、flt1、kdr、flt4。

38、本发明提供的一种用于培养血管化肝脏类器官的培养基，加入bsa有利于微血管和肝脏上皮细胞的共培养，抗生素浓度减半之后，有利于微血管和肝脏上皮细胞的共培养。可用于培养从成体肝脏组织分离获得的细胞，这些细胞可以在二维培养皿中形成多层细胞结构，其中，下层为上皮细胞，上层为微血管和星状细胞。这种含有多层结构的多种细胞培养物即可称为二维血管化肝脏类器官。解决了现有技术中培养基无法实现从同一个成体肝脏组织中分离原代肝脏细胞、星状细胞以及微血管进行体外共培养制备血管化肝脏类器官的技术问题。另一方面提供的一种血管化肝脏类器官的培养方法，通过上述的培养基从同一个成体肝脏组织中分离原代肝脏细胞、星状细胞以及微血管进行体外共培养，并利用胞外基质构建不同软硬度的细胞培养外基质基底，以模拟纤维化过程中的组织硬度变化，获得在二维平面上生长的具有多层细胞结构的血管化肝脏类器官。该血管化肝脏类器官不仅具备组织特异性的微血管，也能够准确模拟成体肝脏组织，并通过胞外基质作用获得具有不同硬度微环境的血管化肝脏类器官，以模拟肝脏纤维化过程中组织变硬的不同阶段，实验证明，可用于纤维化研究或药物筛选。解决了现有技术中血管化肝脏类器官的培养技术难以准确模拟成体肝脏组织，且无法模拟肝脏纤维化过程中组织变硬的环境导致无法应用于纤维化研究和药物筛选的技术问题。