一种抗菌肽及其制备方法和应用

本发明涉及多肽，具体涉及一种抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细菌感染是一种常见但严重危害健康的问题，其研究现状一直备受关注，随着抗生素耐药性细菌的不断增加，寻找新的抗生素已成为当今医学领域的重要挑战之一，世界卫生组织发布了一份关于抗生素耐药性细菌和结核病的优先名单。该名单列出了一系列对人类健康构成严重威胁的细菌，包括肠球菌、肺炎链球菌、肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。这些细菌已经对目前常用的抗生素表现出较强的耐药性，使得传统治疗方法变得无效，因此寻找新的抗生素成为当务之急。

2、抗菌肽(antimicrobial peptides,amps)是一类具有抗菌活性的多肽分子，最初是从人类、动物、植物和微生物等天然来源中发现的。抗菌肽被认为是一种潜在的新型抗菌药物，它的作用机制主要包括破坏细菌细胞膜、干扰细菌蛋白质合成、抑制细菌dna、rna合成等多种方式来杀灭多种病原体，有效对抗各种细菌、真菌、病毒等病原微生物。随着生物技术的发展，人们逐渐了解到抗菌肽的结构和功能，并开始通过合成和改造来设计新型抗菌肽。

3、外膜蛋白在细胞质中合成后经内膜转运至细胞周质，经信号肽酶酶切后形成未折叠外膜蛋白，由分子伴侣运送至β-桶状蛋白组装机器(bam)，再由bam正确折叠为“β-桶状”并插入至外膜，而未折叠外膜蛋白在细胞周质中积累会产生毒性。bama在β-桶装配机制(bam)复合体中居核心地位，作为外膜蛋白的基本构件，它肩负着至关重要的使命，首先它作为外膜蛋白插入途径的关键元素，通过与外膜蛋白的互动，促使它们嵌入到细胞外膜；其次，它在细菌的生命进程中扮演着信号转导分子的角色，对细菌的生长、繁殖以及致病过程的调控有着不可或缺的影响，bama是开发新型抗生素潜在的理想靶标。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种新的抗菌肽，本发明还提供了该种抗菌肽的制备方法和应用。具有良好的热稳定性，盐稳定性、低细胞毒性。

2、为了实现上述第一目的，本发明提供了一种抗菌肽，其特征在于，为l构型的氨

3、基酸序列lr-11：

4、r(l)-k(l)-w(l)-f(l)-r(l)-r(l)-w(l)-r(l)-r(l)-w(l)-v(l)(arg-lys-try-phe-ar g-arg-trp-arg-arg-try-val)；

5、或为d构型氨基酸序列dr-11：r(d)-k(d)-w(d)-f(d)-r(d)-r(d)-w(d)-v(d)(arg-lys-try-phe-arg-arg-trp-arg-arg-try-val)。

6、本发明的第二目的是这样实现的：所述抗菌肽在制备抗菌感染药物中的应用。

7、上述方案中：所述抗菌肽在制备抗金黄色葡萄球菌(atcc29213)、铜绿假单胞菌(atcc27853)、粪肠球菌(atcc19434)、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(crpa)、耐多药鲍曼不动杆菌(mdrab)、大肠杆菌(atcc25922)、肺炎克雷伯杆菌(atcc700603)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)药物中的应用。

8、所述抗菌肽在制备家蚕细菌病防治药物中的应用。

9、上述方案中：所述抗菌肽在制备体内外抗家蚕致病菌蒙氏肠球菌药物中的应用。

10、一种所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：通过固相合成法合成制备多肽，选用mbha树脂作为固相载体，先将树脂溶胀后脱保护基，将第一个氨基酸连接到树脂上，接下来继续在树脂上按顺序依次连接上剩下的氨基酸，并在每次连接上后脱去氨基酸上面的fmoc保护基，待完成全部肽链的连接后将抗菌肽从树脂上切割下来，采用高效液相色谱仪进行分离纯化得到。

11、上述方案中：在连接氨基酸时，使用活化剂o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯促进氨基和羧基的偶联反应。

12、上述方案中：用含有体积分数20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液脱去氨基酸上面的fmoc保护基。

13、上述方案中：用三氟乙酸、水、三异丙基硅烷体积比为95％:2.5％:2.5％的混合溶液作为切割液将抗菌肽从树脂上切割下来。

14、本发明发明人针对细菌外膜蛋白bama的活性位点，通过分析抗菌肽序列的氨基酸保守序列和结构-活性关系，关键位点和优势氨基酸(rw)，为了解决抗菌肽的蛋白水解不稳定性使用d型氨基酸取代l型氨基酸，最终优化设计了l-构型的lr-11和d-构型的dr-11。

15、本发明所设计得到的两条抗菌肽具有良好的热稳定性、盐稳定性、蛋白酶耐受性，具有良好的抗菌活性，低细胞毒性和溶血毒性，极具发展潜力及应用价值。另外此抗菌肽还在家蚕蚕病防治中表现出色，能有效的降低家蚕致病菌蒙氏肠球菌的致死率，在蚕业养殖中具有重要应用价值。

16、本发明提供的抗菌肽，采用fmoc固相化学法合成获得，可操作性强，成本低。具有良好的抗菌活性，制备难度低。

技术特征：

1.一种抗菌肽，其特征在于，为l构型的氨基酸序列lr-11：

2.权利要求1所述抗菌肽在制备抗菌感染药物中的应用。

3.根据权利要求2所述抗菌肽在制备抗菌感染药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽在制备抗金黄色葡萄球菌(atcc29213)、铜绿假单胞菌(atcc27853)、粪肠球菌(atcc19434)、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(crpa)、耐多药鲍曼不动杆菌(mdrab)、大肠杆菌(atcc25922)、肺炎克雷伯杆菌(atcc700603)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)药物中的应用。

4.权利要求1所述抗菌肽在制备家蚕细菌病防治药物中的应用。

5.根据权利要求4所述抗菌肽在制备家蚕细菌病防治中的应用，其特征在于：所述抗菌肽在制备体内外抗家蚕致病菌蒙氏肠球菌药物中的应用。

6.一种权利要求1所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：通过固相合成法合成制备多肽，选用mbha树脂作为固相载体，先将树脂溶胀后脱保护基，将第一个氨基酸连接到树脂上，接下来继续在树脂上按顺序依次连接上剩下的氨基酸，并在每次连接上后脱去氨基酸上面的fmoc保护基，待完成全部肽链的连接后将抗菌肽从树脂上切割下来，采用高效液相色谱仪进行分离纯化得到。

7.根据权利要求6所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：在连接氨基酸时，使用活化剂o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯促进氨基和羧基的偶联反应。

8.根据权利要求7所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：用含有体积分数20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液脱去氨基酸上面的fmoc保护基。

9.根据权利要求8所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：用三氟乙酸、水、三异丙基硅烷体积比为95％:2.5％:2.5％的混合溶液作为切割液将抗菌肽从树脂上切割下来。

技术总结本发明公开了一种抗菌肽及其制备方法和应用，其特征在于，为L构型的氨基酸序列LR‑11：R(L)‑K(L)‑W(L)‑F(L)‑R(L)‑R(L)‑W(L)‑R(L)‑R(L)‑W(L)‑V(L)(Arg‑Lys‑Try‑Phe‑Arg‑Arg‑Trp‑Arg‑Arg‑Try‑Val)；或为D构型氨基酸序列DR‑11：R(D)‑K(D)‑W(D)‑F(D)‑R(D)‑R(D)‑W(D)‑V(D)(Arg‑Lys‑Try‑Phe‑Arg‑Arg‑Trp‑Arg‑Arg‑Try‑Val)。本发明所设计得到的两条抗菌肽具有良好的热稳定性、盐稳定性、蛋白酶耐受性，具有良好的抗菌活性，低细胞毒性和溶血毒性，极具发展潜力及应用价值。另外此抗菌肽还在家蚕蚕病防治中表现出色，能有效的降低家蚕致病菌蒙氏肠球菌的致死率，在蚕业养殖中具有重要应用价值。技术研发人员：王远强,邹旭,陈洪游,彭佩琪,夏庆友,梁浩然,郭璟黎,钟林倚,任美霖受保护的技术使用者：重庆理工大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14