嵌合型启动子及其用途的制作方法

本发明涉及一种嵌合型启动子及其用途，特别是涉及一种包含pp-gmubi3元件和cp-csvmv元件的嵌合型启动子及其用途。

背景技术：

1、植物基因工程的目标之一是产生具有农业所需特征或性状的植物，通常期望的性状包括提高营养价值品质、增加产量、赋予病虫害抗性、提高干旱和胁迫耐受性、提高园艺品质和赋予除草剂抗性等。目前的技术进展已使研究人员能够获取外源多核苷酸分子(例如异源或天然来源的基因)，并将该多核苷酸分子整合到植物基因组中，该基因在植物细胞中表达以表现出相应的性状。重要的是适当的调控信号必须以合适的结构存在才能在植物细胞中获得新插入基因的编码序列的表达。这些调控信号典型地包括启动子区域、5’非翻译引导序列和3’转录终止子/聚腺苷酸化序列。

2、基于对天然嵌合型启动子亚元件结构及功能认知并深入研究了启动子起始转录的作用机制，通过对相关启动子进行嵌合改造，可以获得自然界不存在的人工合成的嵌合启动子，并且该人工合成的嵌合启动子指导rna合成的能力与天然“嵌合型启动子”相当或更强。

3、现有文献技术中已经描述了一些在植物细胞中起作用的嵌合型启动子，这些启动子包括花叶病毒的增强子元件可操作地连接拟南芥细胞延伸因子基因的启动子prattsf1或油菜的细胞延伸因子基因的启动子prbntsf1，例如花椰菜花叶病毒camv 35s启动子具有的重复增强子元件e35s以及玄参花叶病毒(fmv)35s启动子具有的重复增强子元件efmv，上述嵌合启动子efmv:prattsf1等已经应用在转基因表达的植物构建体中。利用基因工程改良商业化种质的多个性状需要进行基因堆积将多个基因引入到作物中。由于当将多个基因引入作物时，关键因素是给每个基因搭配合适的启动子以获得最佳表达，并需使用不同的启动子以降低基因沉默的可能性。因此，在植物基因工程技术中基因表达的最佳控制和启动子多样化是非常重要的。尽管目前已获得了一些嵌合型启动子，但是人工改造合成功能更强的嵌合型启动子仍然倍受关注，这些人工合成的嵌合启动子能够控制目的基因以不同水平进行表达，以及应用于基因叠加在相同转基因植物中多基因的表达。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新的嵌合型启动子及其用途，该启动子能够使异源核苷酸序列在植物组织中高效表达。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种嵌合型启动子，其包含pp-gmubi3元件和cp-csvmv元件，所述pp-gmubi3元件与cp-csvmv元件可操纵地连接，且所述pp-gmubi3元件位于所述cp-csvmv元件的上游；

3、其中，所述pp-gmubi3元件和cp-csvmv元件的核苷酸序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。

4、进一步地，本发明提供一种嵌合型启动子，所述嵌合型启动子还包含增强子元件，其中所述增强子元件选自efmv元件、l-csvmv元件和i-gmubi3元件中的至少一种；

5、其中，所述efmv元件、l-csvmv元件和i-gmubi3元件的核苷酸序列分别如seq idno:2，seq id no:5和seq id no:6所示。

6、进一步地，本发明提供了一种嵌合型启动子，所述增强子元件选自efmv元件、l-csvmv元件和i-gmubi3元件的组合。

7、进一步地，所述增强子元件位于所述嵌合型启动子的5’端或3’端。

8、进一步地，按照5’端到3’端的方向，所述efmv元件、pp-gmubi3元件、cp-csvmv元件、l-csvmv元件和i-gmubi3元件依次可操纵地连接。

9、进一步地，所述嵌合型启动子的核苷酸序列如seq id no:1所示。

10、为实现上述目的，本发明还提供了一种包含与目的异源核苷酸序列可操作地连接的上述嵌合型启动子的重组dna构建体。

11、进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

12、为实现上述目的，本发明还提供了一种包含上述重组dna构建体的表达盒。

13、为实现上述目的，本发明还提供了一种包含上述表达盒的重组载体。

14、为实现上述目的，本发明还提供了一种在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，包括：将与上述嵌合型启动子可操作地连接的目的异源核苷酸序列稳定地整合进植物细胞中。

15、进一步地，所述植物为拟南芥、油菜、烟草、大豆、棉花、辣椒、甜菜、南瓜、茄子、大白菜、胡萝卜、番茄、豌豆、菠菜、马铃薯或花生。

16、优选地，所述目的异源核苷酸序列在植物组织中组成型的表达。

17、进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

18、优选地，所述目的异源核苷酸序列编码除草剂耐性蛋白质。

19、优选地，所述目的异源核苷酸序列编码昆虫抗性蛋白质。

20、为实现上述目的，本发明还提供了一种植物或部分，包含上述嵌合型启动子。

21、为实现上述目的，本发明还提供了一种获得加工农产品的方法，包括将上述植物或部分的收获物进行处理以获得加工农产品。

22、为实现上述目的，本发明还提供了一种上述嵌合型启动子用于在植物组织中组成型的表达目的异源核苷酸序列的用途。

23、优选地，所述植物为拟南芥、油菜、烟草、大豆、棉花、辣椒、甜菜、南瓜、茄子、大白菜、胡萝卜、番茄、豌豆、菠菜、马铃薯或花生。

24、进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

25、本发明中术语“包含”、“包括”是指“包括但不限于”。

26、本发明中术语“启动子”是指dna调节区，通常含有能够引导rna聚合酶ii在特定编码序列的适合转录起始位点启动rna合成的tata盒。本发明中术语“基因”是指在适宜的调控区域(例如植物可表达性启动子区域)控制下在细胞内含有被转录成rna分子(例如mrna)的dna区域(“转录的dna区域”)的任何dna片段。因此，基因可能含有几种可操作性连接的dna片段，例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区域和含有多聚腺苷酸化位点的3’非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。重组dna构建体是通常不在植物物种中发现的任何基因，或者是在天然情况下其启动子与部分或全部转录的dna区域或者与该基因的至少另一调控区域无关的任何基因。

27、本发明中术语“嵌合型启动子”是指具有启动子活性的寡核苷酸。根据本发明的“寡核苷酸”应理解为包含100-2500个核酸、优选500-2000个核酸、更优选1000-1900个核酸、最优选1600-1850个核酸的单链或双链dna或rna分子。本发明的嵌合型启动子可通过基因工程方法对现有的启动子进行结构改造，例如通过基因工程方法将两个或多个启动子元件可操纵地连接从而形成本发明的嵌合型启动子。

28、本发明中术语“增强子元件”是指增进、改进或改善核酸序列转录或翻译的序列元件(例如dna序列)，而无论其相对于待表达的核酸序列的位置和方向。增强子可以增强来自单一启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。增强子可以刺激启动子的活性并且可以是该启动子的固有元件或插入的异源元件以增强启动子的转录水平。增强子能够在两个方向(正常或翻转)上进行操作，并且甚至当移动到该启动子的上游或下游时还能发挥作用。只要保留或基本上保留(例如，至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的野生型活性，也就是说全长序列的活性)改善转录的这个功能，(天然存在的)野生型增强子序列的任何截短、突变或其它修饰变体也在上述定义范围内。

29、本发明中术语“组成型的表达”是指基因或目的异源核苷酸序列在植物的大部分或全部的组织和/或生长发育阶段表现出相对稳定和持续的表达，例如，花椰菜花叶病毒camv35s启动子，它能够在植物中启动外源基因在大多数器官和不同的发育时期高强度的表达；组成型启动子亦能够确保grna在宿主细胞中的广泛表达，提高基因编辑的效率和精确度。

30、具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。

31、本发明提供了一种嵌合型启动子，其包含pp-gmubi3元件和cp-csvmv元件，所述pp-gmubi3元件与cp-csvmv元件可操纵地连接，且所述pp-gmubi3元件位于所述cp-csvmv元件的上游；

32、其中，所述pp-gmubi3元件和cp-csvmv元件的核苷酸序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。

33、pp-gmubi3元件和cp-csvmv元件是本发明的嵌合型启动子发挥活性的关键启动子元件。包含这两个启动子元件的嵌合型启动子即可启动目的异源核苷酸序列在植物组织中的表达。

34、进一步地，本发明的嵌合型启动子还包含增强子元件，以用于增强启动子的转录水平，该增强子元件可以位于所述嵌合型启动子的5’端或3’端。其中所述增强子元件选自efmv元件、l-csvmv元件和i-gmubi3元件中的至少一种；

35、其中，所述efmv元件、l-csvmv元件和i-gmubi3元件的核苷酸序列分别如seq idno:2，seq id no:5和seq id no:6所示。

36、本发明所述的启动子序列及其片段，当组装进dna结构使启动子序列与目的异源核苷酸序列可操作地连接时，用于遗传性操控任何植物。所述“可操作地连接”是指本发明的启动子序列与第二个序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和调节对应于第二个序列的dna序列的转录。一般地，可操作地连接是指被连接的核酸序列是连续的，必要时相邻地结合两个蛋白编码区，并在同一个阅读框内。以此方式，启动子核苷酸序列与目的异源核苷酸序列构成所述重组dna构建体在表达盒中一起提供，以在目的植物中表达。这种表达盒提供了大量限制性位点以插入目的异源核苷酸序列，所述目的异源核苷酸序列将受到包含本发明启动子序列的调节区的转录调节。表达盒可另外含有至少一个将共转化进生物体的附加基因。可选择地，附加基因可以在多个表达盒上被提供。在本发明中，术语“可操作地连接”和“可操纵地连接”可互换使用。

37、表达盒可另外含有可选择的标记基因。一般地，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。所述选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。所述选择性标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因(如编码新霉素磷酸转移酶ii(npt))和潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，以及赋予除草剂抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-d)抗性基因。

38、表达盒包括沿5’-3’方向转录的本发明的启动子序列、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、和在植物中起作用的转录和翻译终止区。目的异源核苷酸序列可以是天然的或对植物宿主外源的或异源的。可选择地，目的异源核苷酸序列可以是天然序列或选择性合成序列。“外源”是指在导入转录起始区的天然植物中不存在所述的导入转录起始区。例如，重组dna构建体包含本发明的启动子序列，本发明的启动子序列可操作地与不同于本发明的启动子序列的编码序列连接。

39、终止区可来源于本发明的启动子序列，也可来源于可操作连接的目的异源核苷酸序列，或可来源于另外的来源。传统的终止区可从土壤农杆菌的ti质粒获得，如肉碱合成酶和胭脂碱合成酶(nos)终止区。

40、在表达盒制备中，可以操控不同的dna片段以提供适当方向的dna序列，并在适合的时候提供适当的阅读框。所以，可应用接受子或连接子结合dna片段，或可进行其它操控以提供方便的限制性位点、去除多余的dna、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，如转变和转换。

41、在适合的情况下，目的异源核苷酸序列可被优化以增加在转化植物中的表达量。即可用植物优选的密码子合成基因以改善表达。

42、本领域公知的，另外的序列修饰可提高细胞宿主中的基因表达水平。这些包括但不限于，去除编码假性聚腺苷信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子的重复序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表达的序列。序列的g-c含量可调节到指定宿主细胞的平均水平，引用宿主细胞中己知的基因表达水平进行计算。可能地，修饰序列以避免预测的发夹式mrna二级结构。

43、在表达盒或重组载体中，表达盒可另外含有5’前导序列。所述前导序列可以起改进转录效率的作用。所述前导序列为本领域已知的，包括但不限于，细小核糖核酸病毒前导序列，例如emcv前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯病毒组前导序列，例如烟草蚀刻病毒(tev)前导序列、玉米矮小花叶病毒(mdmv)前导序列和人免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)；来自紫花苜蓿花叶病毒包被蛋白mrna(amv rna4)的非翻译前导序列；烟草花叶病毒(tmv)前导序列；和玉米萎黄病斑点病毒(mcmv)前导序列。还可以使用其它己知的改进转录效率的元件，例如内含子等。

44、本发明的启动子序列可用来启动与目的异源核苷酸序列的信使rna(mrna)至少部分互补的反义结构的转录。构建反义核苷酸序列以与相应的mrna杂交。只要反义序列长到可与相应的mrna杂交并干扰其表达，就可进行反义序列的修饰。以此方式，可以使用与相应的反义序列具有80％，优选的90％，更优选的95％序列同一性的反义结构。此外，反义核苷酸序列的一部分可被用来破坏靶基因的表达。一般，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更多个核苷酸的序列。

45、本发明的启动子序列被用于目的异源核苷酸序列的组成型的表达。“异源核苷酸序列”是指非天然地与启动子序列一起存在的序列。虽然所述核苷酸序列与启动子序列是异源的，但对植物宿主可能是同源的或天然的或异源的或外源的。可操作地与本发明的启动子连接的异源核苷酸序列可编码目的蛋白质。这种异源核苷酸序列的实例包括但不限于，编码赋予以下抗性多肽的核苷酸序列：非生物应激如干旱、温度、盐度、臭氧和除草剂，或生物应激如病原体侵袭，包括昆虫、病毒、细菌、真菌和线虫类，并防止产生这些生物体伴随的疾病。

46、本发明中除草剂耐性蛋白质可以表达对除草剂的抗性和/或耐受性。这些基因包括但不限于，羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)基因、原卟啉原氧化酶(ppo)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因、5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(epsps)基因、草胺磷乙酰转移酶(pat)基因、草甘膦氧化还原酶(gox)基因、gat基因等。

47、本发明中“昆虫抗性”是指植物避免植物-昆虫相互作用所致的症状和损害。即阻止昆虫引起的植物损害、农作物损害、植物损形和植物疾病，或可选择地，将由昆虫引起的植物损害、农作物损害、植物损形和植物疾病减少到最小或减轻。所述昆虫可以属于鳞翅目(如玉米螟)、半翅目(如椿象)、鞘翅目(如甲虫)、直翅目(如飞蝗)、同翅目(如蚜虫)、双翅目(如蝇)等。本领域公知的，目的昆虫抗性蛋白质包括但不限于，芽孢杆菌毒性蛋白；凝集素类，其中凝集素包括雪花莲凝集素、豌豆凝集素、刀豆凝集素、麦芽凝集素、马铃薯凝集素、花生凝集素等；脂氧化酶类，其中脂氧化酶包括豌豆脂氧化酶1或大豆脂氧化酶；昆虫壳多糖酶等。

48、不同害虫将病毒从感染的植物传递给健康植物的方式不同。所述病毒包括但不限于，水稻东格鲁杆状病毒、烟草花叶病毒、甘薯萎黄矮小病毒和甘薯羽状斑点病毒等。因此，可以选择在植物组织中组成型的表达具有抗致病原体活性或使病毒病原体的影响最小化的异源核苷酸序列。

49、本发明的启动子序列和方法可用于任何目的异源核苷酸序列在植物宿主中的表达调节，以改变植物的表现型。各种目的表现型改变包括但不限于，改变植物的脂肪酸成分、改变植物的氨基酸含量、改变植物病原体防御机制等。上述改变可以通过提供异源产物的表达或增加植物内源性产物的表达而得到。可选择地，上述改变可以通过减少植物中一个或多个内源性产物的表达而得到，特别是酶或辅助因子。上述改变将导致转化植物的表现型改变。

50、转化方案以及将核苷酸序列导入植物的方案依定向转化的植物或植物细胞类型而异，即单子叶植物或双子叶植物。将核苷酸序列导入植物细胞并随后插入植物基因组中的适合方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将dna摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的dna导入。

51、已经转化的细胞可按照常规的方式生长成植物。这些植物被培育，用相同的转化株或不同的转化株授粉，得到的杂交体表达所需的被鉴定的表现型特征。可培育二代或多代以保证稳定地保持和遗传所需表现型特征的表达，然后收获可保证得到所需表现型特征表达的种子。

52、术语“植物”包括整株植物，包括全部植物和植物种群，例如需要的和不需要的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可以是通过传统育种和优化方法或通过生物技术和重组方法，或这些方法的组合而获得的植物，包括转基因植物。

53、术语“植物部分”包括植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞。所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的dna分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

54、在一方面，植物部分是植物细胞。在又另一方面，植物部分是不可再生细胞或可再生细胞。在另一方面，植物细胞是体细胞。

55、不可再生细胞是指不能通过体外培养再生为整株植物的细胞。不可再生细胞可以在本发明的植物或植物部分(例如叶)中。不可再生细胞可以是种子或所述种子的种皮中的细胞。成熟的植物器官(包括成熟的叶、成熟的茎或成熟的根)包含至少一个不可再生细胞。

56、在另一方面，植物细胞是生殖细胞，如胚珠或作为花粉一部分的细胞。在一个方面，花粉细胞是营养(非生殖)细胞，或精子细胞。

57、本发明提供了由包含本发明所述嵌合型启动子的植物或部分的收获物进行处理以获得加工农产品。术语“加工农产品”指的是由源自包含本发明嵌合型启动子的植物、种子、植物细胞或植物部分的材料组成的任何组合物或产品。具体的，术语“加工农产品”包括但不限于蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、面粉、生物质和种子油。

58、本发明提供了一种嵌合型启动子及其用途，具有以下优点：

59、1、本发明人工构建了包含pp-gmubi3元件和cp-csvmv元件的嵌合型启动子。

60、2、本发明嵌合型启动子几乎在植物的大多数组织和许多类型细胞中都显示出活性，特别是在植物的根、茎、叶、花、荚皮、果实中。

61、3、本发明嵌合型启动子可驱动外源基因在植物组织中组成型的表达。

62、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。