一种用于等温条件下鉴别诊断羊绵羊泰勒虫的试剂盒及可视化检测方法

本发明涉及生物，具体涉及一种用于等温条件下鉴别诊断羊绵羊泰勒虫的试剂盒及可视化检测方法。

背景技术：

1、羊泰勒虫属于泰勒科泰勒属的蜱传型血液原虫，通常大量寄生于绵羊和山羊淋巴细胞、巨噬细胞或红细胞内，进而引发血液原虫病。感染后的羊会发育不良甚至死亡，严重影响了畜牧业的发展。目前公认感染羊的泰勒虫有6种，分别是绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、莱氏泰勒虫、分离泰勒虫、隐藏泰勒虫。目前我国报道的羊泰勒虫主要有绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫。羊感染泰勒虫后，精神状态会越来越差，情绪不稳定，出现抑郁倾向，食欲差或不进食，高烧，心律不齐、贫血、淋巴结肿大等症状。且各泰勒虫之间的症状并无显著的差异，因此，无法仅仅通过临床症状判断感染的类型。

2、目前，羊泰勒虫病实验室诊断的方法主要有病原形态观察、血清学检测及pcr检测。血涂片或淋巴结涂片染色法是最传统的实验室诊断方法，该方法简便、廉价，但是依赖于检测人员的寄生虫形态学经验，当染虫率较低或隐性感染时存在漏检，该方法的准确性有待验证，且上述方法忽略了载体动物，干扰信号从成像焦平面以外进入而使画面分辨率降低，而且由于不同种泰勒虫在形态上具有相似性而难以区别。

3、随着检测技术的不断更新，羊泰勒虫病的检测方法也有了迅速的发展。目前，间接免疫荧光试验(ifa)、酶联免疫吸附试验(elisa)、胶体金免疫层析试纸条(ics)等血清学检测方法已用于羊泰勒虫病的检测。尤其elisa是我国应用最主要、最广泛的血清学检测方法，虽然血清学检测方法具有易于操作、可大量检测样品等优点，但是不能将尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫进行区分，且与其他梨形虫存在交叉反应的问题。pcr检测由于其特异性高、灵敏性好、快速等优点，为泰勒虫病的诊断提供了更准确的手段。例如发明专利cn103146836b公开了鉴定和检测多种羊泰勒虫的试剂盒及制备方法，所述的试剂盒包括有三对特异性引物，它们分别是：羊吕氏泰勒虫上、下游引物，羊尤氏泰勒虫上、下游物和绵羊泰勒虫上、下引物。

4、本发明根据绵羊泰勒虫核糖体大亚基rna基因序列设计了几组lamp引物，并对lamp引物进行了筛选，得到的lamp引物序列和对应的靶序列可以检测绵羊泰勒虫，并建立了一种检测绵羊泰勒虫的lamp-lfb方法，该lamp-lfb检测方法特异性高、灵敏性高，能准确、快速的检测绵羊泰勒虫。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种用于检测绵羊泰勒虫的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如seq id no.33所示。

2、本发明的第二目的是提供一种用于检测绵羊泰勒虫lamp引物组，所述lamp引物组包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物、lf引物和lb引物；所述fip引物的核苷酸序列如seqid no.5所示，所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述lf引物的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.32所示。

3、本发明的第三目的是提供一种用于检测绵羊泰勒虫的的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的lamp引物组，所述fip引物的5′端标记异硫氰酸荧光素，所述lf引物的5′端标记生物素。

4、优选的，所述试剂盒建立了lamp反应体系：内外引物浓度比例为2:1～12:1，mgso4的浓度为2～12mmol/l，dntp mix的浓度为0.6～2.2mmol/l，反应温度设置为60～66℃，反应时间设置20～70min。

5、优选的，所述的lamp反应体系：内外引物浓度比例为6:1，mgso4的浓度为6mmol/l，dntpmix的浓度为1.4mmol/l，反应温度设置为64℃，反应时间设置40min。

6、本发明的第四目的是提供利用所述的试剂盒在非诊断目的的检测绵羊泰勒虫中的应用。

7、本发明的第五目的是提供一种绵羊泰勒虫的lamp可视化检测方法，包括以下步骤：

8、(1)提取待测样品的dna；

9、(2)将步骤(1)提取得到的dna，加入权利要求3-5任一项所述试剂盒中进行反应；

10、(3)对反应结果进行判定：当dna扩增产物中存在如seq id no.33所示靶序列时，t线、c线均显色，判定为阳性；只有c线显色，标记为阴性；t线、c线均不显色，判定为无效。

11、本发明的第六目的是提供利用所述的lamp引物组在非诊断目的的检测绵羊泰勒虫中的应用。

12、本发明的有益效果是：本发明提供了用于检测绵羊泰勒虫的靶序列和对应靶序列的lamp引物，并筛选建立了lamp体系，内外引物浓度比例为2:1～12:1，mgso4的浓度为2～12mmol/l，dntp mix的浓度为0.6～2.2mmol/l，反应温度设置为60～66℃，反应时间设置20～70min；使用所述的lamp引物组和lamp体系制备了用于检测绵羊泰勒虫的试剂盒，所述的试剂盒在检测绵羊泰勒虫时，具有特异性高、敏感性高以及临床可行性强的特点，且操作简单，不需要复杂的仪器，检测成本低。

技术特征：

1.一种用于检测绵羊泰勒虫的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如seqid no.33所示。

2.一种用于检测绵羊泰勒虫lamp引物组，其特征在于，所述lamp引物组包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物、lf引物和lb引物；所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述f3引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述lf引物的核苷酸序列如seqid no.31所示，所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.32所示。

3.一种用于检测绵羊泰勒虫的的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求2所述的lamp引物组，所述fip引物的5′端标记异硫氰酸荧光素，所述lf引物的5′端标记生物素。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒建立了lamp反应体系：内外引物浓度比例为2:1～12:1，mgso4的浓度为2～12mmol/l，dntp mix的浓度为0.6～2.2mmol/l，反应温度设置为59～66℃，反应时间设置20～70min。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的lamp反应体系：内外引物浓度比例为6:1，mgso4的浓度为6mmol/l，dntp mix的浓度为1.4mmol/l，反应温度设置为64℃，反应时间设置40min。

6.利用权利要求3-5任一项所述的试剂盒在非诊断目的的检测绵羊泰勒虫中的应用。

7.一种绵羊泰勒虫的lamp可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.利用权利要求2所述的lamp引物组在非诊断目的的检测绵羊泰勒虫中的应用。

技术总结本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于等温条件下鉴别诊断羊绵羊泰勒虫的试剂盒及可视化检测方法；还提供了用于检测绵羊泰勒虫的靶序列和对应靶序列的LAMP引物组，并筛选建立了LAMP体系：内外引物浓度比例为2:1～12:1，MgSO<subgt;4</subgt;的浓度为2～12mmol/L，dNTPMix的浓度为0.6～2.2mmol/L，反应温度设置为59～66℃，反应时间设置20～70min；使用所述的LAMP引物组和LAMP体系制备了用于检测绵羊泰勒虫的试剂盒，所述的试剂盒在检测绵羊泰勒虫时，具有特异性高、敏感性高以及临床可行性强的特点，且操作简单，不需要复杂的仪器，检测成本低。技术研发人员：赵帅阳,朱浩瀚,张少华,刘军龙,关贵全,罗建勋,殷宏受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心）技术研发日：技术公布日：2024/11/18