一种基于RPA-CRISPR的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)特异性靶标、引物和检测体系及方法

本发明属于食品检测。更具体地，涉及一种基于rpa-crispr的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的特异性靶标、rpa引物和检测体系及方法。

背景技术：

1、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌种类繁多，其中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)是唯一能引起健康人群食物中毒的亚种，其与其它非产毒亚种间同源性高，因此检测及区分难度较高。目前，我国检验标准gb 4789.29-2020《食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验》采用传统微生物学方法对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)进行检测鉴定，该方法采用微生物平板培养和生理生化鉴定，具有准确度高，稳定性好和成本较低的优点，但样本前处理复杂，检测耗时长，技术要求高，难以实现现场快速高效的检测。其它方法均以核酸为靶标，以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为检测对象，其中包括pcr法、实时荧光pcr法和微滴式数字pcr法。这些方法尽管灵敏度较高，但都不能区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)与其它亚种，且依赖于昂贵且笨重的大型仪器，操作繁琐，不利于有关监管部门的现场快速检测。

2、近年来，许多dna等温扩增技术如lamp、rpa等应需而生，这为现场快速核酸检测提供了可能。目前，dna等温扩增技术被广泛报道用于致病菌的检测当中，例如，马晓燕等(2013)根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16s～23srrna中的特异性靶标序列设计了lamp检测方法，结果指出lamp检测方法较pcr表现出更高的特异性和灵敏度。然而，lamp技术需要引物设计复杂，容易出现非特异性扩增。相对地，rpa技术引物设计原则简单，对靶标选择性强，扩增效率高，但是rpa扩增后仍需纯化扩增产物并结合核酸电泳来判断检测结果，操作繁杂，信号输出强度差。更进一步地，zheng等(2023)基于16s～23srrna核酸靶标，采用crispr/cas12a蛋白结合rpa检测食品中的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，通过crispr/cas12a蛋白快速且特异性识别扩增产物中的核酸靶标，并激活自身核酸酶活性，从而不加区分地切割荧光探针，输出大量荧光信号，检测效率高，灵敏度高，耗时短，适用于现场快速检测，但上述方法所选靶标只具备种间特异性，均无法区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)与其它亚种。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种能够快速且特异性检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的靶标、rpa引物和检测体系及方法。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于检测并区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的特异性碱基序列。

3、本发明的第二个目的是提供一种用于检测并区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的rpa引物。

4、本发明的第三个目的是提供所述rpa引物在检测并区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的产品中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种用于检测并区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的crispr/cas12a检测体系。

6、本发明的第五个目的是提供所述检测体系在检测并区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的产品中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供一种快速检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的方法。

8、本发明的第七个目的是提供一种用于检测并区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的试剂盒。

9、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

10、本发明基于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)产米酵菌酸毒素编码基因，在ncbi网站中下载米酵菌酸生物合成基因簇，将毒力基因序列输入ncbi网站的blast模块，搜索并下载其所有同源序列，利用snapgene软件对所有序列进行比对以筛选特异性碱基序列，最后在bond区筛选到一段具有亚种间特异性的碱基序列。

11、根据rpa试剂盒操作指南《assay design manual》设计基于此特异性靶标的rpa引物，通过琼脂糖凝胶电泳选择一组扩增效率最高、特异性最好的引物对，所述rpa引物具有良好的亚种间特异性，适用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的检测及区分。

12、本发明通过在靶标序列区间上的pam位点进行设计crrna，crrna序列可分为两部分，靠近5'端的部分是固定碱基序列，3'末端部分与靶dna的非靶链互补，由此得到了一条针对靶标序列的高特异性crrna，其对靶标dna片段具有高度特异性。

13、在上述rpa引物和crrna的基础上，本发明结合标记有fam报告基团的ssdna-fq荧光报告探针构建了一种用于检测并区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的crispr/cas12a检测体系，并建立了快速检测并区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的方法。由于本发明所设计rpa引物和crrna兼具高特异性和高灵敏度，可直接煮沸法或试剂盒所提取dna模板进行rpa扩增，无需复杂的样品前处理和微生物富集步骤，最终实现唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的快速荧光视觉检测。

14、本发明提供了一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的特异性靶标，靶标序列seq id no.1所示。

15、本发明提供了一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的rpa引物d11-f/d11-r，引物序列如seq id no.2～3所示。

16、本发明所述rpa引物d11-f/d11-r具备高特异性和高灵敏度的特点，可用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的检测和区分。

17、因此，本发明申请保护所述rpa引物d11-f/d11-r在检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)或制备检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的产品中的应用如seq id no.2～3所示。

18、本发明还提供了一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的rpa-crispr/cas12a检测体系，其中包括rpa引物d11-f/d11-r，crrna，crispr/cas12a蛋白和ssdna-fq荧光报告探针；所述crrna的序列如seq id no.4所示，所述ssdna-fq荧光报告探针的序列如seq id no.5所示。

19、本发明同时申请保护上述检测体系在检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)或制备检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的产品中的应用。

20、优选地，所述ssdna-fq中带有fam荧光基团和bhq淬灭基团，见实施例2。本发明还提供了一种快速检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的方法，其包括以下步骤：

21、1.提取待测样品dna；

22、2.以步骤1所得dna为dna模板，用所述rpa引物d11-f/d11-r进行核酸恒温扩增；

23、3.用所述检测体系中的crrna、ssdna-fq荧光报告探针和crispr/cas12a蛋白配制检测体系，加入步骤2所得扩增产物进行反应；若在蓝光照射下，空白对照无荧光，阳性对照与所检样品产生绿色荧光，则所检样品中含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)。

24、当阳性对照无绿色荧光或空白对照出现绿色荧光，说明存在操作失误或试剂被污染的情况。

25、优选地，步骤1中采用煮沸法提取待测样品dna或采用试剂盒获得基因组dna，见实施例4。

26、优选地，步骤2所述核酸恒温扩增反应的反应体系中，引物d11-f/d11-r的终浓度为0.448μm，见实施例1。

27、优选地，dntps的终浓度为1.6mm，见实施例1。

28、优选地，b buffer或mgoac终浓度为16mm，见实施例1。

29、具体地，步骤2所述核酸恒温扩增反应的反应体系为：4μl c buffer，1μl lbuffer，2.4μl p-core，0.4μl dntps(10mm each)，引物d11-f/d11-r终浓度为0.448μm，0.56μl b buffer，dna模板1μl，总体系10μl。

30、优选地，步骤2所述核酸恒温扩增反应的反应条件为37℃，25min，见实施例1。优选地，步骤3所述检测体系中，cas12a的终浓度为80nm，crrna的终浓度为80nm，ssdna-fq荧光报告探针的终浓度为200nm，见实施例2。

31、具体地，步骤3所述crispr/cas12a荧光检测体系为：crispr/cas12a检测体系：2.5μl 10×nebuffer 2.1，2μl cas12a(1μm)，2μl crrna(1μm)，0.5μl ssdna-fq(10μm)，0.5μlrnase抑制剂(0.4u)，7.5μl ddh2o，总体系15μl。

32、优选地，步骤3所述反应的反应条件为37℃，20min，见实施例2。

33、具体地，本发明所述样品包括但不限于椰子水、大米粉和糯米粉等。

34、本发明还提供了一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的试剂盒，所述试剂盒中含有rpa引物d11-f/d11-r，crispr/cas12a蛋白，crrna和ssdna-fq荧光报告探针

35、本发明具有以下有益效果：

36、(1)本发明所述靶标序列、rpa引物和crrna均具有很高的特异性，只对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)靶标dna片段进行特异性扩增，不会对其它亚种进行非特异性扩增和识别检测，基于所述靶标序列、rpa引物和crrna所构建的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检测方法具有高特异性和高灵敏度的特点，适用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的检测，结果准确。

37、(2)本发明所构建的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检测方法，在不依赖于实验室环境情况下，实现对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的快速检测，操作简便，耗时短，适用于现场快速检测，实用性强。本发明通过优化rpa恒温扩增和rpa-crispr/cas12a反应的反应条件和反应程序，在恒温(37℃)条件下，即可完成扩增和检测，rpa扩增过程仅需25min，crispr/cas12a检测过程仅需20min。此外，结合煮沸法，可以在15min内实现对样品的前处理和dna提取，在没有微生物富集的前提下，整个过程能缩短至60min，具有较高的检测效率。

38、(3)本发明通过检测椰子水、大米粉和糯米粉人工添标样本发现，通过煮沸法或商用试剂盒提取样品dna，对三种样本的检测限达100cfu/ml，灵敏度较高，满足现场检测需求。

39、(4)本发明所建立的用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的rpa-crispr/cas12a检测方法，适用于椰子水、大米粉和糯米粉等检验，适用范围广，且与林捷等(2020)建立的实时荧光pcr法的检测结果完全一致，可靠性高，适用于相关监管部门的快速检测。