一种高效制备蝙蝠蛾拟青霉原生质体的方法

(一)本发明属于工业微生物，具体涉及一种高效制备蝙蝠蛾拟青霉原生质体的方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、蝙蝠蛾拟青霉(paecilomyces hepiali)是从新鲜冬虫夏草中分离出来的一种虫生真菌，其有效活性成分包括腺苷、虫草酸、虫草素和无机元素等，具有与冬虫夏草高度相似的生物活性，在医药和保健品行业得到了广泛的应用。关于蝙蝠蛾拟青霉研究的报道目前主要集中在其活性成分以及药理作用研究等方面，面对巨大的应用市场，对蝙蝠蛾拟青霉进行菌种改良研究可以更好满足市场发展需要。

2、原生质体是微生物菌种改良、遗传育种的良好材料，高效的原生质体制备体系可为后续原生质体诱变、原生质体融合、原生质体转化等奠定良好的基础。研究表明，不同的微生物由于其细胞壁组成成分不同，原生质体制备条件也存在较大差异。目前关于蝙蝠蛾拟青霉原生质体制备的研究鲜见报道，仅有1篇学术论文和1项专利申请提及，但均未开发出蝙蝠蛾拟青霉的专用原生质体制备的配方，而且各自有不足之处。

3、上述的1篇相关论文(宋细忠,龚伯梁,徐长豪,等.蝙蝠蛾拟青霉原生质体紫外诱变育种[j].食用菌学报,2010,17(04):15-17.doi:10.16488/j.cnki.

4、1005-9873.2010.04.005.)中，研究者通过对蝙蝠蛾拟青霉的原生质体进行紫外诱变进行菌种改良，但文中参考的方法是灵芝原生质体制备的方法，论文叙述了方法但没有提及原生质体得率和再生率这两个基本指标。

5、专利申请cn117187076a公开，所述原生质体制备是将蝙蝠蛾拟青霉菌丝洗净后加入溶菌酶进行酶解，溶菌酶的主要功效是分解细菌细胞壁，主要应用于细菌原生质体制备，虽然在酵母菌原生质体制备中也有应用，但只是作为辅助，效果较差，因为真菌的细胞壁结构中主要是葡聚糖、甘露聚糖和几丁质，不是溶菌酶的底物，而细菌细胞壁主要是肽聚糖等成分，相差较大。

6、蝙蝠蛾拟青霉和蝙蝠蛾被毛孢是同被列入《可用于保健食品的真菌菌种名单》的两种冬虫夏草真菌，关于蝙蝠蛾被毛孢的原生质体研究已经有大量的文献和专利报道，但是目前尚无针对蝙蝠蛾拟青霉的原生质体制备方案。

技术实现思路

0、(三)技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种高效制备蝙蝠蛾拟青霉原生质体的方法，利用此方法制备的蝙蝠蛾拟青霉原生质体可达3.18×107个/ml，制备的原生质体可以应用于菌种改良，具有重要的应用价值。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种高效制备蝙蝠蛾拟青霉原生质体的方法，所述方法包括如下步骤：(1)菌丝的培养与预处理：蝙蝠蛾拟青霉菌丝块接种至液体pda培养基中，19℃～25℃静置培养3天，离心(优选8000rpm离心5min)收集菌丝，用氯化钾水溶液洗涤菌丝2～3次，离心去上清，得到预处理后的菌丝；

4、(2)酶液的配置：取裂解酶，溶解于氯化钾水溶液中，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，收集滤液，即为酶液；所述裂解酶为yatalase或driselase中的一种或两种的混合；

5、(3)原生质体的制备与纯化：向步骤(2)酶液中加入步骤(1)预处理后的菌丝，置于19～25℃摇床中，100-200rpm酶解1-5h；酶解结束后，用滤布过滤去除大部分菌丝，滤液离心(优选4000rpm离心10min)后去除上清液，沉淀用氯化钾水溶液重悬，洗涤2～3次后，得到纯化后的原生质体；

6、(4)原生质体的再生：将步骤(3)原生质体用氯化钾水溶液稀释后，涂布于再生培养基上，置20℃～25℃培养箱中培养，获得蝙蝠蛾拟青霉再生菌落；再生培养基组成：10g/l麦芽糖、10g/l葡萄糖、5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、10g/l蚕蛹粉、0.1g/l mgso4、0.2g/lkh2pso4，溶剂为水。

7、进一步，步骤(1)蝙蝠蛾拟青霉为蝙蝠蛾拟青霉(paecilomyces hepiali)mz-549462。

8、进一步，步骤(1)到(4)中氯化钾水溶液浓度均为0.6-1.0m，均优选0.8m。

9、进一步，步骤(1)液体pda培养基组成：200g/l土豆，20g/l葡萄糖，10g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蚕蛹粉，溶剂为水。

10、进一步，步骤(2)裂解酶质量用量以氯化钾水溶液体积计为2.5～5mg/ml，优选5mg/ml。

11、进一步，步骤(2)裂解酶为yatalase和driselase以质量比1：1的混合。

12、进一步，步骤(3)预处理后的菌丝质量用量以酶液体积计为100～200mg/ml，优选150mg/ml。

13、进一步，步骤(3)酶解的条件为22℃、120rpm酶解3h。

14、进一步，步骤(4)原生质体用氯化钾水溶液稀释至浓度1.0×104个/ml。

15、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

16、本发明提供了一种高效制备蝙蝠蛾拟青霉原生质体的方法，采用yatalase和driselase配置的混合酶液，能够获得较高得率的原生质体，可达31.83×106个/ml；同时所得的原生质体能成功再生，再生率为2.54％，为利用原生质体技术改良蝙蝠蛾拟青霉的研究奠定了基础。

技术特征：

1.一种高效制备蝙蝠蛾拟青霉原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)菌丝的培养与预处理：蝙蝠蛾拟青霉菌丝块接种至液体pda培养基中，19℃～25℃静置培养3天，离心收集菌丝，用氯化钾水溶液洗涤菌丝2～3次，离心去上清，得到预处理后的菌丝；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)蝙蝠蛾拟青霉为蝙蝠蛾拟青霉(paecilomyces hepiali)mz-549462。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)到(4)中氯化钾水溶液浓度均为0.6-1.0m。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)到(4)中氯化钾水溶液浓度均为0.8m。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)液体pda培养基组成：200g/l土豆，20g/l葡萄糖，10g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蚕蛹粉，溶剂为水。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)裂解酶质量用量以氯化钾水溶液体积计为2.5～5mg/ml。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)裂解酶为yatalase和driselase以质量比1：1的混合。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)预处理后的菌丝质量用量以酶液体积计为100～200mg/ml。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)酶解的条件为22℃、120rpm酶解3h。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)原生质体用氯化钾水溶液稀释至浓度1.0×104个/ml。

技术总结本发明公开了一种高效制备蝙蝠蛾拟青霉原生质体的方法，采用Yatalase和Driselase配置的混合酶液，能够获得较高得率的原生质体，可达31.83×106个/mL；同时所得的原生质体能成功再生，再生率为2.54％，为利用原生质体技术改良蝙蝠蛾拟青霉的研究奠定了基础。技术研发人员：曹龙雨,朱廷恒,潘磊,李桂全,熊卢健受保护的技术使用者：浙江工业大学技术研发日：技术公布日：2024/11/18