显微镜照明设备、带有暗场照明设备的显微镜、在血液分析方面的用途和试样照明方法与流程

本发明涉及一种用于显微镜的透射光照明设备，特别适用于暗场显微术、荧光显微术和瞬逝试样照明。

背景技术：

1、cn105739075 a是一种基于led的暗场照明设备，但只能用于落射。

2、已知心形聚光镜，例如us20070127117 a1中的心形聚光镜，可以用于暗场照明，但其价格昂贵且能效低。

3、us1999240 a公开了一种带有椭圆形反射镜的暗场聚光镜。其缺点在于照明能效低。

4、us20160363753 a1公开了一种带有led环形灯的显微镜照明设备，用于荧光透射光照明和暗场透射光照明。用于暗场照明的发光二极管由不反光的套环单独定位和准直。该灯光通过套环和自由光路穿过聚光镜，并引导至试样。其缺点在于可达到的数值孔径较小。因此这种暗场照明设备不适合高倍率。

5、此外，wo2014/041820a1公开了一种带有发光二极管的暗场照明设备，其灯光穿过明场聚光镜，并通过自由光路引导至试样。其缺点在于可达到的数值孔径较小。

6、helmut hund gmbh公司的出版物中公开了用于暗场显微术的方法，并描述了多种聚光镜类型(haus,

7、technischegrundlagendunkelfeldmikroskopie，wetzlar，2008年，发表于：

8、“https://www.hund.de/images/pdf/mikroskopie/dunkelfeldmikroskopie_naturheil praktiker_mit_hund-logo.pdf”)。由该出版物可知，由于对比度较差，带有中央光阑的阿贝聚光镜在高倍率暗场显微镜中的适用性有限。尽管缩小显微镜物镜的光圈可以提高对比度，但会降低分辨率。该出版物公开了使用带有传统聚光镜的暗场显微镜进行的原生血液分析。

9、网络出版物“https://correctiv.org/faktencheck/2021/12/20/dieses-video-beweist-nicht-dass-in-covid-19-impfstoffen-wuermer-sind-oder-das-blut-von-geimpften-zusammenklebt/”也公开了使用暗场显微术的血液分析。然而，目前还没有用于制备无肝素毛细管血液切片和在暗场中分析这类切片的标准化方法。us2017/0 292 905a1公开了光学方式的血液分析，特别是在多个焦面上进行记录以及对图像进行评估。

10、cn 1 02 004 307a公开了一种用于荧光显微术，设计用于落射式照明的照明装置。其中，光纤耦合光源发出的光线首先借助于锥形反射镜产生环形光束，随后，该环形光束借助成像系统经由显微镜物镜投射到试样上。其缺点在于系统复杂，并且发光效率较低。

11、us2019/0 064 496a1公开了一种用于分析生物试样的显微镜，该显微镜带有用于观察试样的目镜。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种适用于暗场显微术且具有高数值孔径(na)的低价、高效的照明设备，提供这样一种显微镜，并指定一种对试样进行此类照明的方法。

2、解决方案

3、根据权利要求1所述的照明装置、权利要求14所述的显微镜和权利要求16所述的照明方法达成了这一目的。此外，还指定了根据权利要求17所述的照明装置的用途。

4、发明优点

5、该照明装置价格低廉，可以达到高na值，并且适用于高倍率浸没式显微术。与自由放射的环形灯光装置相比，这里所介绍的照明装置可以达到超过1的na值。此外，它可以设计为较低的结构高度，必要时可以安装在显微镜载物台上。此外，这里所介绍的显微镜还可与价格低廉的非眩光物镜配合使用，例如高倍率的浸没式物镜(如100倍，na 1.25)，以便在暗场中观察试样。该照明装置也可以用于荧光显微术，并在相应高na值的情况下用于瞬逝试样照明。

6、技术方案

7、下面介绍一种根据本发明，且特别适用于暗场显微术的照明装置。

8、本发明包括一种用于显微镜的透射光照明装置，具有

9、●带对称轴的旋转对称聚光镜本体、平面出光面和多个凸面入光面，

10、其中，在出光面上布置有试样和/或带有试样的试样载体；

11、●多个发光二极管(led)，每个发光二极管可发出具有中心光线的光束，其中，从多个发光二极管发出的光束的中心光线位于发光二极管和聚光镜本体之间的第一光线区段内，并且中心光线被布置在第一钝锥的第一圆锥曲面上，并且为每个光束分别分配一个入光面。

12、入光面可以是聚光镜本体弯曲外表面的表面区段，发光二极管的光束通过这些表面区段分别进入聚光镜本体。入光面可以通过不用于进光的表面区段加以分隔。但是如果相邻发光二极管的光束在进入聚光镜本体时发生重叠，则入光面也可以相互连接。如果聚光镜本体的形状为球体圆盘(英语中称为spherical segment、spherical frustum)，则可以把该外表面称为球面区。如果聚光镜本体的形状为截球体(英语中称为spherical dome，可视为球体圆盘的一种特例)，或者尤其是作为半球体，则可以把该外表面称为球形帽，也可以称为球形罩或帽盖。需要注意的是，英语中的“spherical segment”一词可以理解为球体圆盘，而非截球体。截球体或球缺体是球体与一个平面相交而分隔开的一部分。球缺体的形状为拱顶，具有圆形圆盘作为底面。半球体是球缺体的一种特例，其截面包含了球心。

13、对称轴可按z方向布置。z方向可以是观测光束路径的方向。观测光束路径的光轴可以与对称轴重合。可以定义一个垂直于z方向的x方向和一个y方向，如此xyz方向便构成了一个直角坐标系。出光面可以设计成平面，由于聚光镜本体的旋转对称性，该平面垂直于聚光镜本体的对称轴布置。

14、发光二极管可发射光束。如果为各个发光二极管提供电气工作电流，就能在实际上发射光束。中心光线可以理解为代表了光束的光输出量的角分布重心的光线。这束光线也可以称为主发射方向。根据本发明，光束的中心光线位于聚光体本体中从各个入光面直射至出光面的各个第二光线区段内，并且中心光线被布置在第二钝锥的第二圆锥曲面上。这就意味着中心光线向一个点，即第二锥尖汇聚。第一钝锥和第二钝锥同轴于对称轴布置。钝锥是指锥尖角大于90°、可作为全角测量的圆锥体。其优势在于，每束中心光线在入光面上的入射角，即中心光线与入射点处入光面的表面法线的夹角，可以小于15°，这就意味着中心光线的入射角较垂直入射的最大偏差为15°。这样就能最大限度地减少偏振伪影、散光伪影和色差伪影。第二圆锥曲面可以与第一圆锥曲面相同，也可以与之不同。如果中心光线的入射角为0°，即垂直入射聚光镜本体，则第一圆锥曲面和第二圆锥曲面可以相同。第二锥体可以有利地设计为，使出光面的中心光线的数值孔径(na)介于0.8至1.4之间，优选在1.1至1.4之间，特别优选在1.25至1.4之间。这里可以把na理解为平均环形孔径，该na也可以对试样起作用。该平均环形孔径可以表示可由照明装置产生的倾斜照明的内孔径和外孔径之间的平均值。锥半角α2/2,(即第二锥角α2的一半)的正弦可以通过na除以聚光镜本体的折射率n计算得出。锥半角α2/2可以是中心光线与z方向的夹角。合适的第二锥角α2(全角)的计算公式为

15、α2＝2*arcsin(na/n)

16、例如如果使用折射率为1.518的聚光镜本体，并设置na为1.3，则可以计算出合适的第二锥角为117.82°。使用透射光照明装置对试样进行照明时，以平均环形孔径的形式加以测定的数值孔径优选大于1，特别优选大于1.25。可以有利地设置na小于1.33。如果试样中含有要在含水环境中观察的物体，则后者可能会很有利。如果na值超过了水的折射率，会发生全内反射，这样可能会降低试样的光输出量和/或导致更多的不必要的散射光。对于其他试样介质，例如甘油、树脂或油，也可以使用更高的数值孔径。第二锥角可以优选小于140°，特别优选在110°和125°之间。第一锥角可以优选小于140°，特别优选在100°和125°之间。

17、根据折射定律，第一锥角α1可由第二锥角α2和第二光线区段与聚光镜本体入光面的法线之间的夹角计算得出。对此也可以使用光线追踪程序。同样可以计算出发光二极管的有利布置位置，如此发光二极管的中心光线在穿过聚光镜本体和试样载体(如有必要)后，会汇聚到试样位置。为了确定发光二极管的最佳位置，可以相应地放置第二锥体，从而使锥尖位于试样中。如此便可以确定第二圆锥曲面与聚光镜本体外表面的交线，入光面位于该外表面上。在xz截面上，这可以是中心光线与相关入光面的交点。然后相应地放置第一锥体，使第一圆锥曲面与聚光镜本体具有相同的交线。这样在xz截面上，就可以分别确定入光面上第一光线区段和第二光线区段几何交汇的各个点。

18、发光二极管可以与聚光镜本体间隔预定的距离布置，其主发射方向位于由此确定的第一光线区段的直线上。将发光二极管与聚光镜本体之间的距离保持在尽可能小的范围内是有利的，例如0至3mm之间，特别优选小于2mm。该距离可以确定为各中心光线的自由光路的长度。通过短距离，可以最大限度地降低照明装置的结构高度。此外，照明的均匀性也会好于更大的距离。

19、优选设置3至128个发光二极管，特别优选8至128个。事实证明，外壳直径为3mm、数量为12个的发光二极管形成了一个有利的实施例。这些发光二极管可以围绕半径为7.5mm的截球形聚光镜本体。直径更小的发光二极管同样有利，如此就会有更多的样本与聚光镜本体间隔预定距离安放在预定的第一圆锥曲面上。这样就能实现更高的光照强度。如果需要照亮试样平面中更大的物场，即更大的试样面，则直径更大的发光二极管同样有利。

20、多个发光二极管可作为发光二极管存在于各自的发光二极管外壳中，并且有利地分别具有外壳透镜(前透镜)，通过该透镜可以将各自的发光束准直到30°或更小的发散度(fwhm)，特别是在10°到25°之间。原则上，也可以用更小的发散度准直发光二极管，或者以几乎理想的方式准直。然而相较于准直更好的发光二极管，例如准直到15°至25°的发光二极管可能要便宜很多。此外，当光线进入聚光镜本体时，由于入光面凸起，光线会再次形成光束。如果来自发光二极管的光辐射在聚光镜本体的入光面处被理想地准直，或者甚至会聚，这可能会导致在试样平面上的待观察试样区域照明不均匀。在最坏的情况下，发光二极管的发光面可能会在试样上成像，这样发光二极管的图像可能会在试样图像中造成叠加伪影。因此与理想准直相比，上述范围内的发光二极管光束的发散度是有利的。

21、外壳透镜同时也可以是发光二极管的出光面。发光二极管的出光面与待照明试样之间的光束路径可以有利地设计为在整个路线上都不产生反射。这样做的优点在于，与已知的心形聚光镜相比，无需制作反射面。

22、试样可以直接布置在出光面上。为此例如在液体介质中待观察的物体可以直接施加到出光面上。或者也可以设置试样载体。该试样载体例如可以是显微镜中常用的载玻片。试样载体也可以是透明的板状体，至少带有流体通道，试样流经该通道。在后一种情况下，可以对流通的试样进行持续观察。

23、试样载体可以通过浸没介质与出光面进行光学耦合。试样载体也可以通过光学贴合与出光面进行光学耦合。试样载体还可以通过狭缝与出光面进行光学耦合。在最后一种情况下，狭缝的厚度可以优选小于照明光线的平均波长(设计波长)的四分之一，以避免光损失。例如浸油可以用作浸没介质，尤其是在业余爱好领域，diy店的甘油(甘油醇)也可以用作浸没介质。

24、可以用盖玻片盖住试样。为此，可以使用市售的例如厚度在0.08mm到0.25mm之间的显微镜盖玻片。盖玻片的厚度可以优选为0.17mm，显微镜的常规标准物镜可以就该厚度进行校正。盖玻片和显微镜物镜之间可以设置一定间隔，以便观察试样。对于干物镜，该间隔可以设计成自由光路，而对于浸没式物镜，该间隔则可以有利地利用浸没介质填充。

25、可以有利地在发光二极管和聚光镜本体之间布置光阑。这些光阑可以用于遮住光束的边缘光线。这样可以提高暗场图像的对比度。光阑孔可以是圆形的，例如有利地设计为直径在0.5mm到2mm之间。光阑孔也可以有利地设计为椭圆形或矩形，其中较小的维度，即椭圆形结构中的短轴或矩形结构中的短边，可以垂直于第一圆锥曲面布置。这样就可以通过狭窄的环形孔径以更大的面照射试样。

26、多个发光二极管可以有利地布置为，分别与入光面的距离小于入光面的平均曲率半径，尤其是小于入光面的曲率半径的一半。第一光线区段可以有利地设计为自由光路。第一光线区段可以在空气中传播。

27、聚光镜本体的基本形状可以是回转椭球截段圆盘或椭圆抛物面截段圆盘。球体圆盘，尤其是截球体的基本形状尤为有利。就本发明而言，球体圆盘可以理解为出自于截球体的旋转对称体，具体方法是从截球体中截取一个更小的截球体。通过截取更小的截球体而产生的球体圆盘表面可以称之为盖面。由于球体圆盘的旋转对称性，截段基面、盖面与外表面(盖帽)的交线可以位于平行的平面上。盖面可以具有明场入光面的功能。截球体或者说球体圆盘所基于的截球体可以有利地小于或等于半球体。特别有利地，聚光镜本体的基本形状为半球体，或者截段高度(帽高)为球体半径减去试样载体的预定标称厚度d的截球体。在光学效果不佳的地方，聚光镜本体可以偏离基本形状，但也可以完全设计成这种基本形状。聚光镜本体优选具有3mm到15mm之间的球半径，特别优选在5mm到10mm之间。出光面可以设计为圆形，半径优选在3mm到15mm之间，特别优选在5mm到10mm之间。出光面可以是截球体的基面，该基面也被称为截段基面。凸形入光面可以有利地布置在外表面(球面区或球形帽)上。球形帽可以理解为截球体上表面的弯曲部分，在这种情况下也可以表示球面区。而对于球体圆盘，球面区可以理解为圆盘所基于的截球体的盖帽中属于圆盘的部分。凸形入光面的曲率半径优选在3mm至15mm之间，特别优选在5mm至10mm之间。

28、第二圆锥曲面可以有利地与第一圆锥曲面具有相同的锥角。如果聚光镜本体的基本形状是截球体，且该截球体的截段高度为球体半径减去试样载体的预定标称厚度d，则这种情况特别有利。在这种情况下，基本形状为球体圆盘同样有利，这样，球体圆盘的截段高度可以与球体圆盘所基于的截球体相关联。

29、第二圆锥曲面的锥角也可以比第一圆锥曲面更大。如果聚光镜本体的基本形状是半球体或半球体圆盘，即球心位于一个截面(即出光面)上的球体圆盘，则这种情况尤为有利。

30、可以有利地在与出光面相对的聚光镜本体上设置用于另一个光束的明场入光面，从而对试样进行平行照明。平行照明可以是科勒照明。例如明场入光面可以设计为与出光面相对的球形圆盘状聚光镜本体的表面。明场入光面可以有利地设计为平面，也可以有利地设计为凹面。明场入光面也可以设计为凸面。这种具有凸面或凹面(即非平面)盖面的聚光镜本体可以称之为广义的球体圆盘。应该注意的是，本发明意义上的球体圆盘也可以理解为这种广义的球体圆盘，即具有平面的截段基面和可以设计为平面、凸面或凹面的盖面。此外，应注意的是，截球体可以视为球体圆盘的一种特例。在这种特殊情况下，球面区可以设计成球形帽。

31、根据本发明的显微镜可以有利地具有：

32、●上述的根据本发明的透射光照明装置，

33、●物镜和

34、●目镜和/或图像传感器。

35、如果物镜(26)的na小于透射光照明装置的环形孔径，该显微镜适宜用于暗场显微术。对于特殊任务，对试样进行瞬逝照明同样有利。后者尤其可以通过使透射光照明装置的na大于试样介质的折射率来实现。在这种情况下，光束会在试样介质上发生全反射，试样只会受到瞬逝(交叉衰减)光波的照射。

36、透射光照明装置还可以有利地包括带有聚光镜本体容纳槽的外壳。如果用于第二种运行模式的聚光镜本体可以移除，并且透射光照明装置在该第二种运行模式下无需浸没介质和聚光镜本体即可对试样进行透射光照明，则这种情况尤其有利。根据所用显微镜物镜的不同，第二种运行模式可以是对试样进行倾斜明场照明或进一步的暗场照明。在没有聚光镜本体的情况下，照明设备的na可以为na＝sin(α1/2)，其中，α1是第一锥角(可以确定为全角)。凹槽可以有利地制造为具有正公差，即略大于聚光镜本体。然后可以借助薄薄一层(约0.5μm-100μm)浸没介质将聚光镜本体以可拆除，以及必要时可移动的方式固定在试样载体上。试样载体可以放置在外壳上，如此聚光镜本体就会伸入容许正公差的凹槽中，而不会出现机械过量测定的风险。

37、如果能对发光二极管进行单独控制和/或分成若干组进行控制，则是有利的。然后可以使用不同的照明拍摄多张照片，并通过图像处理增强对比度。

38、如果聚光镜本体在光学功能表面之外的表面上配有光散射和/或光吸收处理，特别是磨砂和/或发黑处理，则是有利的。对此，聚光镜本体可以有利地通过浸没介质或透明粘合剂在外壳凹槽中连接外壳材料。例如外壳可以由黑色塑料或黑色阳极氧化铝制成。外壳可以有利地具有低结构高度，例如在5mm至12mm之间。然后，根据本发明的透射光照明装置可以安装在市售显微镜的显微镜载物台上，其中，结构高度很低，从而可以在显微镜现有的聚焦范围内聚焦试样。

39、显微镜可以有利地包括浸没式物镜，其可以使用浸没介质进行操作。

40、可以有利地使用根据本发明的透射光照明装置或根据本发明的显微镜用于分析切片或试样，该切片或试样例如在水性试样介质中含有生物研究对象。生物研究对象例如可以是薄到透明的细胞或组织切片。可以尤其有利地使用根据本发明的透射光照明装置或根据本发明的显微镜对血液试样(尤其是原生血液试样)进行暗场分析。

41、根据本发明，还设计了一种对试样进行照明的方法，包括：

42、●通过各自的发光二极管产生多个光束，其中，每个光束都具有中心光线，并且从发光二极管射出的中心光线被布置在第一钝锥的第一圆锥曲面上的第一光束区段内，

43、●将光束分别耦合到带有对称轴的旋转对称的聚光镜本体的凸形入光面，该聚光镜本体具有平面的出光面。

44、●光束直射到聚光镜本体的出光面，

45、●光束与出光面解耦，

46、●将从出光面射出的光束耦合到直接或通过试样载体布置在出光面上的试样中。

47、试样载体可以放置在聚光镜本体的出光面上，或者通过薄薄一层(厚度例如为0.5μm-100μm)浸没介质与聚光镜本体的出光面进行光学耦合。