一种木糖诱导型CRISPRa系统载体及其构建方法和应用

本发明涉及合成生物学工具，特别是涉及一种木糖诱导型crispra系统载体及其构建方法和应用。

背景技术：

1、crispra-基因调控技术是基于失活的dcas9蛋白融合转录激活因子可以随着grna通过碱基互补配对结合到感兴趣的基因位置。2018年，ian wheeldon教授在解脂耶氏酵母构建基于dcas9融合vpr转录因子的crispra系统，成功激活内源性纤维二糖代谢基因使解脂耶氏酵母能在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长。但是这种激活方式使得每个dcas9只有一种调控方式。jesse g.zalatan在酿酒酵母中开发了基于rna结合蛋白的crispra系统，在sgrna中插入ms2或者pp7适配体，通过rna结合蛋白融合相应的转录因子，达到相应的激活效果，并且应用于调控紫色杆菌素及其前体的合成。长期的表达cas蛋白和持续的强化表达目标基因会影响细胞生长甚至让细胞失去表型，为了条件控制cas蛋白和目标基因的强化程度，添加诱导剂可以很好的解决这些问题。2021年suryang kwak在布拉迪酵母构建了基于半乳糖和cu2+诱导性crispra系统，使酵母细胞可以探测半乳糖利用的能力强弱。2018年anja hofmann利用半乳糖诱导启动子和雌激素诱导启动子偶联crispra系统在酿酒酵母中构建了and逻辑门基因电路。2022年william m.shaw首先在酿酒酵母中开发了接近无泄漏的启动子，并由此诱导表达大阵列的grna，构建了诱导性正交型crispra系统，并应用于强化琥珀酸的合成，使琥珀酸的产量在诱导后提高了45倍。尽管目前许多诱导型crispra系统在酿酒酵母中成功构建，但是这个在非常规酵母解脂耶氏酵母中还未曾探索过。

2、酿酒酵母中有天然的半乳糖操纵系统，为构建诱导性crispra系统提供便利，木糖作为自然界最广泛存在的纤维糖之一，其利用潜力巨大。先前研究开发了木糖生物传感器，强化木糖利用和柚皮素合成途径。本发明通过木糖诱导型启动子控制mcp-vpr的表达，条件控制crispra系统，为了在解脂耶氏酵母构建and基因电路，本发明利用木糖双向诱导启动子同时控制dcas9和mcp-vpr，并应用于木糖利用途径，构建的木糖诱导型crispra系统可以检测解脂耶氏酵母细胞利用木糖的能力。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种木糖诱导型crispra系统载体及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过双向诱导表达控制，同时控制dcas9和激活域mcp-vpr的表达，增强系统载体激活强度，且发现转入该系统载体的解脂耶氏酵母可以代谢木糖，显示了木糖诱导型crispra系统载体在内源性基因的条件性调控功能，且能够检测解脂耶氏酵母细胞利用木糖的能力。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种木糖诱导型crispra系统载体的构建方法，包括以下步骤：

4、mcp-vpr融合片段和含ms2结构结合位点的sgrna插入含有dcas9片段的pcrisprylsmai位点，得pcrispra载体；

5、随即优化所述ms2结构，选取wtf6插入到所述sgrna中，得galsg4wtf6，之后将galsg4wtf6插入pcrispra smai位点，得到pcrispragalsg4wtf6系统载体；

6、将木糖传感器与pcrispragalsg4wtf6系统载体偶联，获得木糖诱导型crispra系统载体；

7、所述mcp-vpr融合片段的制备方法如下：

8、利用引物p2f和p3r将mcp片段和vpr片段进行pcr融合；所述mcp片段的核苷酸序列如seq id no：81所示；所述vpr片段的核苷酸如seq id no：82所示；

9、所述dcas9片段通过序列如seq id no：1-2所示的引物p1f和p1r从p13dcas9中扩增获得；

10、所述galsg4wtf6包含galsg4和wtf6；所述galsg4的序列为agcgggcgacagccctccga；所述wtf6的序列如seq id no：101所示；所述木糖传感器包含pvprhxbios1或pvprhxbdes1。

11、进一步地，所述引物p2f的核苷酸序列如seq id no：5所示；所述引物p3r的核苷酸序列如seq id no：8所示。

12、进一步地，所述木糖诱导系统(pvprhxbios1)与crispra系统(pcrispragalsg4wtf6)偶联的方法如下：

13、利用引物p14f和p14r从pvprhxbios1中扩增出pxoptef，利用引物p15f和p15r从pcrispragalsg4wtf6系统载体中扩增出mcp-vpr，将pxoptef和mcp-vpr插入pvprhx1的stui位点。

14、进一步地，所述引物p14f和p14r的核苷酸序列如seq id no：28-29所示；所述引物p15f和p15r的核苷酸序列如seq id no：30-31所示。

15、进一步地，所述木糖诱导系统(pvprhxbdes1)与crispra系统(pcrispragalsg4wtf6)偶联的方法如下：

16、利用引物p17f和p17r1从pvprhxbdes1中扩增pleu-pxo-ptef，利用引物p16f和p16r从p12dcas9中扩增出dcas9，利用引物p17f2和p15r从pcrispragalsg4wtf6系统载体中扩增mcp-vpr，将pleu-pxo-ptef、dcas9和mcp-vpr插入pvprhx的stui位点。

17、进一步地，所述引物p17f和p17r1的核苷酸序列如seq id no：34-35所示；所述引物p16f和p16r的核苷酸序列如seq id no：32-33所示；所述引物p17f2和p15r的核苷酸序列依次如seq id no：36、seq id no：31所示。

18、本发明还提供利用所述构建方法获得的木糖诱导型crispra系统载体。

19、本发明还提供所述的木糖诱导型crispra系统载体在检测解脂耶氏酵母细胞利用木糖能力中的应用。

20、进一步地，将xdhsg2和xkssg1导入解脂耶氏酵母中，再转入所述木糖诱导型crispra系统载体，检测解脂耶氏酵母细胞利用木糖的能力。

21、进一步地，所述xdhsg2的序列为gctcgcatgcgcgctatcta；所述xkssg1的序列为gggaaatttcctagtaacgg。

22、本发明公开了以下技术效果：

23、本发明首次在解脂耶氏酵母中构建rna结合蛋白介导的crispra系统和木糖诱导型crispra系统载体，并通过双向诱导表达控制，同时控制dcas9和激活域(mcp-vpr)的表达，增强激活强度。经实验验证，转入木糖诱导型crispra系统载体的解脂耶氏酵母可以代谢木糖，并且持续不断的消耗木糖，显示了木糖诱导型crispra系统载体在内源性基因的条件性调控功能，且能够检测解脂耶氏酵母细胞利用木糖的能力。