用于TaqMan荧光定量PCR法检测猪痘病毒的试剂盒

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种用于猪痘病毒的taqman荧光定量pcr的试剂盒。

背景技术：

1、猪痘是由猪痘病毒(swine pox virus，swpv)感染引起的一种温和的、急性、典型性皮肤病，主要引起皮肤损伤、形成痘疹、囊泡、脓疱、结痂等症状，被称为猪中的“天花”。猪痘是在生猪养殖过程中较为常见的一种病毒性疾病，在全球多个地区均有报道，包括美国、俄罗斯、欧洲、印度和巴西，在我国主要数呈散发性。患病猪个体虽然死亡率不高，但对机体的生产性能有着重要的负面影响，容易导致养殖场经济效益受到影响。

2、2022年，猴痘在欧洲爆发并迅速在全球蔓延，报道了多起死亡病例，迄今为止仍在世界各地有着深远的影响。作为与其同科的猪痘病毒是否会存在进化加速，目前也成为研究人员的关注点。同时猪痘与口蹄疫、湿疹、猪水疱病和猪丹毒等病症状相似，容易引起误诊。鉴于以上原因，建立一种快速、特异、灵敏鉴别猪群感染swpv的方法具有十分重要的意义。

3、taqman实时荧光定量pcr适合用于临床疾病诊断，且各种类型的样本都适用，包括dna、rna、基因组和转录组等,它是一种更快、更敏感和更具体的方法，尽管探针的成本较高，但是因为其优点广泛应用于临床诊断、医药研究、分子生物研究等方面。根据现有公开文献的记载，目前尚未将taqman实时荧光定量pcr技术用于检测猪痘病毒。国内外目前检测猪痘病毒的主要方法是通过靶向猪痘病毒p35蛋白基因、p42基因、vltf-3基因和orf18-20进行常规pcr检测。虽然常规pcr检测成本低，但是特异性不强，且无法定量检测。

4、因此，本发明拟针对上述技术现状，提出一种快速、高效检测出病毒的新技术。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种用于猪痘病毒的taqman荧光定量pcr的试剂盒。

2、为解决技术问题，本发明的解决方案是：

3、提供一种用于taqman荧光定量pcr法检测猪痘病毒的试剂盒，包括：

4、(1)反应总体积1/2的2×premix ex taq酶；

5、(2)浓度各为10μmol/l的上游引物和下游引物；

6、该两条引物的核苷酸序列分别如seq id no：1和seq id no：2所示，用于在pcr扩增过程中特异性扩增猪痘病毒中央编码区外围c20l-c1l序列中的orf16基因；

7、(3)浓度为10μmol/l的探针，其核苷酸序列如seq id no：3所示；

8、(4)标准阳性模版，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释；

9、(5)余量为无菌双蒸水。

10、作为本发明的优选方案，所述探针的序列5端标记的荧光基团为fam，序列3’端标记的淬灭基团为bhq1。

11、作为本发明的优选方案，所述标准阳性模版为猪痘病毒dna，包含orf16基因第1～第207bp序列。

12、作为本发明的优选方案，所述标准阳性模版经所述引物扩增后，所得的扩增产物与pmd18-t载体连接后获得标准质粒dna；编码所述扩增产物的基因具有seq id no:4所示的核苷酸序列。

13、本发明进一步提供了利用前述试剂盒检测猪痘病毒的taqman荧光定量pcr检测方法，该方法用于非诊断目的，其操作流程如下：

14、(1)核酸提取：提取待检样品中的dna；

15、(2)荧光定量pcr：以提取的核酸为模板，使用所述引物和探针进行taqman荧光定量pcr，获得扩增曲线；

16、(3)结果判断：根据预先建立的标准曲线对扩增曲线进行分析，以确定样本中含有猪痘病毒的情况。

17、作为本发明的优选方案，所述步骤(2)中荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火延伸34s，共计40个循环。

18、作为本发明的优选方案，所述步骤(2)中荧光定量pcr的反应体系如下所示：

19、premix ex taq(probe qpcr)(2×)10μl；10μmol/l上游引物1μl；10μmol/l下游引物1μl；10μmol/l探针0.4μl；dna模板2μl；dddh2o补足至20μl。

20、作为本发明的优选方案，所述步骤(3)中，根据下述方法确定样本中含有猪痘病毒的情况：

21、(a)阳性对照组需有标准s曲线产生；

22、(b)在阴性对照组无曲线产生的情况下，如果待检样品出现典型的s曲线且ct值≦37，判定为猪痘核酸阳性；如果ct值>37或是无ct值，则判定为猪痘病毒核酸阴性。

23、作为本发明的优选方案，所述步骤(3)中，根据下述方法确定样本中的猪痘病毒含量：

24、将标准阳性模版进行连续10倍稀释，获得系列拷贝数梯度的标准质粒dna；按照设定的反应体系和反应程序，每个浓度重复三次进行扩增；反应结束后，根据起始模版拷贝数的对数值和c(t)值绘制标准曲线，并根据标准曲线和所得的待检样品c(t)值计算起始模版拷贝数，从而实现猪痘病毒的定量分析；

25、所述标准曲线的公式如下所示：

26、y＝ax+b,r2；

27、其中，y为拷贝数；x为ct值；a,b均为常数；r2为决定系数。

28、发明原理描述：

29、猪痘病毒(swine pox virus，swpv)的成熟病毒粒子呈砖形或椭圆形，有囊膜，是最大型病毒，在水平方向大小约为320nm×240nm。病毒粒子由一个中央双侧凹陷的核，两个横向的椭圆体和至少两层质膜组成。swpv的基因组约为146kb的双股dna，含有150个阅读框[0rf]，a+t含量为72.5％。和其它种属的痘病毒一样，包含一个139023bp的保守中心基因编码区，该基因区域含有病毒复制和感染的必需基因，包括毒力、宿主范围和组织嗜性的有关基因。基因组的末端有2个反向末端重复序列(identleal invertedtermlnal repeat,itr)，功能可能与调节或逃逸宿主的免疫应答、调节或抑制宿主细胞凋亡、细胞和组织嗜性等有关。

30、在进化生物学和遗传学中，保守序列是指代代发生在不同或相同物种中的相同或相似的dna或rna或氨基酸(蛋白质)序列。这些序列的组成变化很小，有时甚至几代都没有变化。在扩增基因序列时，选择在保守区域设计引物能够更有效的扩增未知的基因。因此，首先找出目的序列中的保守区域并在保守区域内设计引物，也就成为本领域研究人员在引物设计过程中的一种惯性思维。由于猪痘病毒的保守基因数量巨大，要想以逐一排除法针对每一个保守基因进行引物探针设计，然后通过pcr检测验证其有效性，显然是不现实的做法。目前国内外研究人员普遍的做法是，将关注点放在猪痘病毒中央编码区内的保守基因，在有限的小范围内进行引物设计及验证工作。因此，目前常用的主要猪痘病毒靶向基因(如p35蛋白基因、p42基因、vltf-3基因和orf18-20基因等)，也都是位于中央编码区的保守基因。在进行低成本的批量常规pcr检测时，这些靶向基因的敏感度、特异性和重复性能够满足初步的检测需求。

31、但是，与taqman荧光定量pcr检测方法相比，常规pcr检测方法在敏感度、特异性和重复性方面就存在较大差距。更重要的是后者无法实现定量检测，这对于把控早期防控时判断疫情发展和确定用药量尤为重要。此外，如果将目前常用的主要猪痘病毒靶向基因用于taqman荧光定量pcr检测，存在特异性不强、引物扩增效率低、引物探针设计困难等的问题，因而需要寻找更合适的替代靶向基因。

32、痘病毒之间同源性很高，如果在设计试剂盒引物时所针对的靶标基因选择不当，容易导致检测准确性不高、检测结果重复性差等问题。申请人团队突破本领域中针对猪痘病毒中央编码区内保守基因的常规研究思路，将研究方向转移至中央编码区外围。经过深入研究和大量测试后最终发现，位于猪痘病毒中央编码区外围c20l-c1l基因序列与痘苗病毒的同源性比较低，基于该基因设计引物探针能确保引物探针的特异性，并且符合设计引物探针的要求。目前针对c20l-c1l基因的研究成果甚少，已有报道也只是在实现分析扩增时偶有提及对该基因序列的利用，但未曾见过将其直接用作定量pcr检测靶标的对象。

33、申请人团队进一步通过优化反应体系和反应程序，建立了完善的针对swpv的taqman荧光定量pcr检测方法。在此基础上，通过针对不同swpv毒株的全面测试，最终确定c20l-c1l序列中的orf16基因为适合设计特异性探针引物的保守基因，针对该保守基因设计的引物探针用于制备试剂盒，能够检测国内外公开报道的已知不同swpv毒株，且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单、结果可靠等特点，能够为猪痘病毒的快速诊断和早期防控提供重要技术支持。

34、此外，本发明在荧光定量pcr检测的扩增阶段中所用标准阳性模版，包含了猪痘病毒orf16基因第1～207bp序列。经所述引物扩增后，所得的扩增产物与pmd18-t载体连接后获得标准质粒dna。其中，编码所述扩增产物的基因具有seq id no:4所示的核苷酸序列。经过申请人研究团队反复比对测试后确认，该基因序列是猪痘病毒所具备的与其他痘病毒特异性的且是不同毒株保守的，对于确保检测的准确性具有重要意义。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

36、1、本发明针对靶向猪痘病毒c20l-c1l序列中的orf16基因提出了特异性引物和特异性探针；上述引物探针能够适用于优化后的反应条件，在用于试剂盒产品时能够满足实际生产应用。

37、2、本发明基于对病毒靶向基因的核苷酸进行检测，操作简便、快速；特异性好，灵敏度高。由于不受培养条件限制定量检测，能真实反映猪痘病毒发生感染的情况。

38、3、本发明提供的试剂盒可对猪痘病毒进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养和常规pcr的传统诊断方法，并适于在临床实验室广泛推广应用。

39、4、本发明试剂盒的最低检测限度为60copies/μl，与其他猪易感病原没有交叉反应，特异性良好。

40、5、本发明试剂盒的组内变异系数小于1.77％，组间变异系数小于3.69％，具有较好的重复性。

41、6、本发明试剂盒使用方法简单、可靠，能在实际生产中实现swpv病毒的尽早检出、及时防控；由于有着良好的实用价值，对公共卫生事业和养殖经济具有重要意义。